Tabaklama prosesinde kullanılan kimyasallar ve insan sağlığı üzerine etkileri

Nous avons entrepris la caractérisation des gènes cibles des miR-26a, -181a (article I), miR-31 et -125b (résultats partie II) dans le but de mieux comprendre leurs rôles respectifs dans les processus qu’ils régulent. Pour débuter cette caractérisation, nous avons commencé une approche à grande échelle pour définir les ARNm régulés par miR-26a dans les MCF-7 (article I). Cette analyse du transcriptome nous a permis de déterminer que 503 ARNm sont régulés par miR-26a. En particulier nous avons démontré que l’ARNm de PGR est une cible directe de miR-26a (article I). Parmi les 503 gènes, 104 sont sous-exprimés et 399 sont surexprimés. Cette donnée peut sembler paradoxale car on s’attendrait à obtenir plus de gènes sous-exprimés suite à une surexpression du miRNA. Il est fort probable que miR-26a entraîne des effets indirects en modifiant par exemple l’expression des régulateurs transcriptionnels (E2F7, PGR ; tableau S2 article I) qui vont eux-mêmes influencer l’expression des ARNm. Une autre hypothèse serait que sous E2, miR-26a entraîne une augmentation de l’expression

des ARNm en ciblant directement ces derniers. Il a été observé que les miRNAs régulent positivement l’expression des gènes mais dans des conditions de stress ou le cycle cellulaire est bloqué (Vasudevan and Steitz, 2007; Vasudevan et al., 2007). miR-26a en inhibant la prolifération pourrait agir en bloquant le cycle cellulaire, d’où une population importante d’ARNm surexprimés en présence du miRNA.

Sur les 503 gènes régulés par miR-26a, uniquement huit ARNm sont prédits comme cible directe du miRNA (comparaison aux cibles prédites par TargetScan, miRBase, PicTar). Ce pourcentage bien peu élevé (1,6%) pourrait être dû au fait que ce miRNA cible les 5’UTR mais également les ORF. Les trois bases de données que nous avons utilisées sont issues d’algorithmes de prédiction se limitant aux 3’UTR. Les bases de données RegRNA ou encore RNA22 réalisent également des prédictions sur l’ensemble d’un ARNm, néanmoins, la consultation est limitée au cas par cas.

Notre approche a consisté à étudier la régulation de la dégradation des ARNm régulés par miR-26a. Cependant, un ensemble d’expériences pourrait être réalisé afin de déterminer les ARNm régulés au niveau traductionnel par ce miRNA. Une des techniques serait de caractériser à grande échelle le protéome cellulaire en fonction de l’expression d’un miRNA (Baek et al., 2008; Vinther et al., 2006). Cette méthode SILAC (stable-isotope labeling by amino acids in cultured cells) consiste à marquer les protéines d’une condition donnée (sur-

ou sous-expression de miRNA) par un aminoacide contenant un isotope lourd alors que les protéines du contrôle ne sont pas marquées et vice versa. L’analyse par spectrométrie de masse d’un mélange protéique des deux conditions est capable de différencier l’isotope lourd et permet d’identifier de manière quantitative les variations d’expression d’une protéine en fonction du miRNA. Une implémentation de cette méthode, pSILAC (pulse SILAC), permet d’étudier la quantité de protéines néo-synthétisée entre deux échantillons (Selbach et al., 2008). Le but est de marquer sur un temps relativement court les deux conditions, une par un aminoacide avec un isotope lourd et l’autre par le même aminoacide mais avec un isotope mi- lourd. La spectrométrie de masse permet par la suite de distinguer dans un mélange protéique des deux conditions les deux types d’isotopes. Ceci permet d’étudier l’effet spécifique d’un miRNA en s’affranchissant entre autre du temps de demi-vie des protéines qui peut parfois être long.

L’étude à grande échelle d’expression d’ARNm issus des polysomes (cf. annexe figure 2) pourrait être complémentaire au pSILAC. En effet, en fonction de l’expression d’un miRNA, l’analyse de l’augmentation ou de la diminution du recrutement des ARNm dans les polysomes est capable d’indiquer leurs niveaux de régulation traductionnelle (Nakamoto et al., 2005). Néanmoins, certains ARNm sont régulés au niveau de la post-initiation de la traduction par les miRNAs et se retrouvent dans les polysomes (Maroney et al., 2006; Nottrott et al., 2006). Il est donc difficile avec cette méthode de distinguer ces ARNm en particulier. Toutefois, un couplage entre différentes techniques serait approprié et permettrait d’apprécier les divers niveaux de régulation mis en jeu par les miRNAs ainsi que leur impact réel sur la quantité d’ARNm et de protéines. Pour cela, en fonction de l’expression d’un miRNA, une combinaison d’étude de la dégradation des ARNm (transcriptome), de leurs recrutements dans les polysomes et une analyse du protéome donneraient un plus juste aperçu des effets des miRNAs in cellulo. Ces techniques décrivent des régulations post-transcriptionnelles mais ne donnent en aucun cas les ARNm cibles directes des miRNAs. Une méthode expérimentale a été développée afin d’y remédier.

L’expérience, réalisée avec le miRNA dme-bantam, consiste à immunoprécipiter de façon spécifique cette miRNP en association avec ces ARNm cibles (Orom and Lund, 2007). L’approche est basée sur le marquage du miRNA en 3’ par une biotine espacée par une chaîne carbonée en C7. La transfection d’un duplexe de ce miRNA est capable de réduire l’expression d’un gène rapporteur mais également d’immunoprécipiter son ARNm via une colonne de streptavidine. L’analyse transcriptomique des ARNm immunopurifiés permet alors de définir les cibles directes du miRNA d’intérêt.

L’utilisation de cette panoplie d’expériences nous permettrait de caractériser les gènes cibles de nos miRNAs d’intérêt mais surtout nous permettrait d’apprécier l’ensemble des mécanismes qu’exerce un miRNA sur la régulation de l’expression post-transcriptionnelle des gènes. Ceci nous aiderait à avoir potentiellement une vue plus exacte de l’influence d’un miRNA ainsi que son rôle dans un processus étudié.