Türk İdare Yargı Kararlarında Ölçülülük İlkesi

Para identificar quais são as proteínas salivares do carrapato R. microplus imunogênicas, ou não, em bovinos resistentes ou suscetíveis, foram realizados Western Blots de géis 2D de salivaS, GSFRmS e GSFRmR seguido de espectrometria de massa. Na Figura 11 e nas Figuras suplementares 4 e 5 poderão ser visualizados quais os spots salivares que foram reconhecidos pelos soros dos bovinos resistentes ou suscetíveis e quais foram selecionados para o sequenciamento nas amostras de salivaS, GSFRmS e GSFRmR, respectivamente. Haverá casos em que a visualização do spot está fraca devido à coloração utilizada nos géis preparativos (comassie R-350) que limita a visualização. Além disso, a limitação dos aparelhos empregados na captação das imagens também favorece para essa resolução prejudicada, além do que pode haver diferença entre uma tira/gel para outra. Portanto, alguns spots podem estar representados e identificados nos Western Blots, mas não nos géis ou vice-versa. Nessa situação, os spots foram coletados, sequenciados e serão apresentados a seguir.

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Gustavo Rocha Garcia Na amostra de salivaS foram identificados aproximadamente 101 spots protéicos, destes, surpreendemtemente, apenas 41 spots foram reconhecidos por soros bovinos, enquanto que 60 spots mesmo presentes na saliva do carrapato não foram reconhecidos por nenhum soro (Figura 11). No Western Blot de salivaS, soros de bovinos suscetíveis não infestados (SSN) reconheceram 14 spots protéicos (a saber, 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 18, 22, 23, 27, 28, 29 e 38) (Figura 11B), sendo que os soros dos mesmos bovinos, porém agora infestados (SSI), reconheceram novamente 14 spots protéicos (a saber, 1, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 26, 28 e 29) (Figura 11C), muito dos quais já tinham sido reconhecidos por estes bovinos antes da infestação (a saber, os spots 1, 5, 6, 7, 11, 28 e 29) (Figura 11B e C). Em adição, os spots 2, 9, 18, 22, 23, 27 e 38 deixam de ser reconhecidos por soros de bovinos suscetíveis após infestação, enquanto que os spots 8, 12, 13, 14, 15, 19 e 26 passaram a ser reconhecidos por estes soros.

Já os soros de bovinos resistentes não infestados (SRN) conseguem reconhecer 19 spots protéicos (1, 5, 6, 7, 11, 12, 14, 16, 17, 24, 25, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 36 e 37), mesmo nunca ter entrado em contato com carrapato (Figura 11D). Após a infestação desses mesmos bovinos (SRI), estes além de permanecer reconhecendo os spots acima (exceto o spot 25), passam a reconhecer também outros 20 spots (a saber, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 13, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 26, 30, 35, 39, 40 e 41) (Figura 11E).

Desses spots reconhecidos, apenas 2 spots (28 e 38) foram reconhecidos exclusivamente por soros de bovinos suscetíveis, enquanto que 20 spots (a saber, 2, 3, 10, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 36, 37, 39, 40 e 41) foram reconhecidos exclusivamente por soros de bovinos resistentes. Em comum, foram reconhecidos 19 spots (a saber, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27 e 29) (Figura 11). A identificação e a possivel função de todos esses spots citados acima, bem como de outros não citados estão descritos na Tabela 14 que será descrita no próximo item.

Figura 11. Western Blot 2D de salivaS. SalivaS foi focalizada usando tiras de 13cm pH3-10L. Peso molecular (kDa) está indicado ao lado esquerdo de cada figura. A) Gel de acrilamida 12,5% contendo 100µg de proteína foi corado com prata. B-E) Géis similares ao mostrado em (A),

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Gustavo Rocha Garcia porém contendo 400µg de proteína foram transferidos para membranas de nitrocelulose e incubados com soros (diluídos 1:100 em forma de pool) de bovinos suscetíveis (B e C) ou resistentes (D e E), antes (não infestado) e depois da infestação (larva, ninfa e adulto), respectivamente. Proteína-G conjugada com peroxidase (1:2000) foi usada para o reconhecimento IgGs bovinas. Os spots reconhecidos estão destacados em (F, realizado da mesma maneira que os géis de B-E) e foram recuperados e analisados por sequenciamento de massa. Spots em amarelo são reconhecidos por soros de bovinos suscetíveis e resistentes, em verde são reconhecidos exclusivamente por soros de bovinos suscetíveis, em vermelho exclusivamente por soros de bovinos resistentes e em roxo por nenhum soro. Alguns spots identificados nos Western blot não aparecem em F (ou vice-versa) devido à resolução/qualidade da imagem.

Já em relação aos imunoproteomas empregando amostras de GSFRmS e GSFRmR, estes apresentaram centenas de spots, porém pouquíssimo spots foram reconhecidos pelos soros bovinos (Figuras suplementares 4 e 5). É importante citar que devido à quantidade de spots presentes nesses extratos, muito dos quais confluentes, ficou extremamente difícil de fazer as combinações/sobreposições entre os géis preparativos com os respectivos Western Blots. Os spots duvidosos não foram coletados. Apesar disso, alguns spots reconhecidos, ou não, por soros bovinos foram identificados, selecionados e sequenciados.

No Western blot de GSFRmS, dos inúmeros spots presentes apenas 12 foram reconhecidos por SSN (a saber, 102, 103, 104, 105, 109, 113, 114, 116, 123, 138, 139 e 140) (Figura suplementar 4B). Destes apenas os spots 104, 105, 109 e 116 continuaram sendo reconhecidos por SSI, além de outros 9 spots (a saber, 108, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127 e 128) (Figura suplementar 4C). Os SRN reconheram 17 spots (a saber, 102, 103, 104, 105, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 116, 117, 118, 119, 120, 121 e 122). Já os SRI continuaram reconhecendo os spots 104, 105, 108, 111, 109 e 120 além dos spots 106, 107 e 115, sendo que os demais spots deixaram de ser reconhecidos (Figura suplementar 4D).

Em geral, os spots 114, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 138, 139 e 140 foram reconhecidos exclusivamente por soros de bovinos suscetíveis, enquanto que os spots 106, 107, 110, 111, 112, 115, 117, 118 e 119 foram reconhecidos apenas por soros de bovinos resistentes. Já os spots 102, 103, 104, 105, 108, 109, 113, 116, 120, 121 e 122 foram reconhecidos tanto por bovinos resistentes quanto por bovinos suscetíveis. Além desses, outros 12 spots (a saber, 133, 134, 136, 137, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 e 148) foram recuperados aleatóriamente por não ter sido reconhecido por nenhum soro bovino.

Por fim, no imunoproteoma de GSFRmR, diferentemente o que acontece com as amostras oriundas de carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, este apresentou poucos spots reconhecidos por soros bovinos. Além disso, dos poucos que foram reconhecidos ficaram difícil de identificar o seu correspondente no gel preparativo, consequentemente difícil de coletar e sequenciar. Resumidamente, os SSN reconheceram aproximadamente 6 spots, porém apenas 1 foi identificado (135) (Figura suplementar 5B), já os SSI reconheceram aproximandamente 21 spots, porém apenas 5 spots foram identificados (129, 130, 131, 132 e 135) (Figura suplementar 5C). Já os SRN reconheceram aproximadamente 2 spots, porém nenhum foi identificado (Figura suplementar 5D), e os SRI reconheceram aproximadamente 17 spots, mas apenas 3 foram identificados (129, 130 e 131) (Figura suplementar 5E). Os spots 135 e 132 foram

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Gustavo Rocha Garcia identificados exclusivamente por soros de bovinos suscetíveis, enquanto que os spots 129, 130 e 131 foram reconhecido por ambas as raças (Figura suplementar 5).

Em geral, nota-se que os bovinos resistentes, mesmo antes da infestação, conseguem reconhecer mais proteínas da saliva e GS de fêmeas alimentadas em bovinos suscetíveis, do que os próprios bovinos suscetíveis, mesmo após a infestação destes. Assim, esses resultados sugerem que o bovino resistente tem uma vantagem ao conseguir neutralizar, desde o início do ciclo parasitário, os componentes salivares enquanto que nos bovinos suscetíveis a neutralização é mais tardia permitindo que o carrapato se estabeleça mais facilmente. Estes resultados corroboram com os resultados obtidos anteriormente pelo nosso grupo, os quais mostram que hospedeiros bovinos resistentes apresentam níveis menores de imunoglobulinas totais em relação aos hospedeiros bovinos suscetíveis, e mesmo assim os resistentes possuem mais anticorpos específicos para proteínas salivares dos carrapatos do que os suscetíveis, inclusive de carrapato alimentado em hospedeiros bovinos suscetíveis (193).

O reconhecimento de spots por soros de bovinos não infestados possivelmente pode ocorrer devido à reação cruzada entre antígenos de outros artropódes que parasitam esses hospedeiros, tais como bernes e moscas do cifre, ou pode ser devido à presença de anticorpos naturais presentes na circulação desses bovinos. Em humanos estes anticorpos naturais são produzidos independente da estimulação antigênica e possivelmente estão associados com a resposta imune inata na defesa contra patógenos, uma vez que apresenta alta afinidade por grupos de carbonos presentes nas membranas de muitos patógenos (228). Já em ovinos, os animais que aguentam infestações com endoparasitas são aqueles que possuem níveis maiores de anticorpos naturais, anticorpos esses que parece confererir proteção contra os endoparasitas (229). Assim, a presença desses anticorpos naturais pode ser importante para a sobrevivência em ambientes naturais, onde os indivíduos são frequentemente expostos a parasitas, como é o caso dos bovinos em relação aos carrapatos. Portanto, independente de como acontece o reconhecimento de proteínas pelos soros desses bovinos sem exposição prévia de carrapato, isso ocorre com maior frequência em bovinos resistentes.

É durante o estágio inicial da fixação, especialmente no estágio de larva, em que acontece uma reação inflamatória nesses hospedeiros decorrente da lesão sofrida pela picada do carrapato. Essa reação inflamatória geralmente é mais intensa em hospedeiros resistentes (21). Também foi demonstrado que proteínas que apresentam atividades

antiinflamatórias são produzidas em maior quantidade em hospedeiros suscetíveis, enquanto que proteínas associadas com atividades proinflamatórias são produzidas mais por hospedeiros resistentes (17). Assim, estes resultados sugerem que os hospedeiros resistentes são mais eficientes em reconhecer proteínas salivares do carrapato, principalmente durante os estágios iniciais da infestação, consequentemente estes hospedeiros podem interfirir com mais eficiência a progressão da infestação por carrapato. Além disso, essas proteínas reconhecidas por soros de hospedeiros resistentes, bem como as não reconhecidas por nenhum soro bovino podem ser candidatos importantes para futuras alternativas de controle do carrapato.

A seguir serão apresentados os resultados da espectrometria de massa dos spots reconhecidos, ou não, por soros bovinos.

4.5.2. Resultados dos sequenciamentos dos spots previamente