Em tecidos traqueais obtidos de animais sensibilizados e desafiados pela inalação de OVA, foram adicionadas concentrações cumulativas de KCl, inicialmente na ausência e, posteriormente, na presença 30 ou 100 µg/mL de OEOM. Conforme já descrito, na ausência de OEOM, a CE50para o KCl foi de 50,2 [43,1 - 57,4] mM (n
= 5) e o Emax foi correspondente a 193,1 ± 29,4% (n = 5) da contração induzida por 60 mM de K+. O tratamento das preparações com OEOM 30 ou com 100 µg/mL não
foi capaz de alterar a sensibilidade tecidual ao KCl, uma vez que os valores de CE50 foram 56,8 [49,1 - 64,4] mM e 66,9 [49,6 - 84,1] mM, respectivamente, e não apresentaram diferença significativa em relação ao controle (p > 0,05, ANOVA), embora o último valor tenha apresentado valor limítrode de p (0,07), tendendo a se tornar significativo. Por outro lado, o OEOM foi capaz de reduzir a magnitude da resposta máxima induzida pelo KCl. Com OEOM 30 µg/mL, o Emax foi 157,6 ± 23,9% da contração de K+ 60 mM, mas não foi estatisticamente diferente, enquanto
que com OEOM a 100 µg/mL, o valor de Emax foi significativamente menor (68,0 ± 11,6% da contração de K+ 60 mM) (p < 0,05, ANOVA).
KCl (mM) 10 100 C o n tr a ç ã o ( % d e K + 6 0 m M ) 0 50 100 150 200 Controle OEOM 30 µg/mL OEOM 100 µg/mL
*
Figura 16 - Curva concentração efeito do KCl em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados na ausência e na presença de OEOM.
Gráfico com os valores médios da resposta contrátil do KCl sobre traquéias isoladas de ratos sensibilizados e desafiados (n = 5) na ausência e na presença de OEOM a 30 ou 100 µg/mL; os valores são expressos como média ± E.P.M.
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho demonstra as ações miorrelaxantes e antiespasmódicas do óleo essencial de Ocimum micranthum (OEOM) em tecidos isolados de traquéia de rato. Além disso, demonstramos também que seu principal constituinte, o cinamato de metila, pode ser responsável por parte de seus efeitos e que o OEOM possui efeito seletivo em tecidos submetidos a processo inflamatório decorrente da apresentação de antígeno sensibilizante a animais previamente sensibilizados.
Há relatos de que o Ocimum. micranthum, também conhecido como “alfavaca da folha miúda”, é tradicionalmente utilizado no tratamento de distúrbios respiratórios (SILVA; PINHEIRO, 2008) e nossos experimentos mostram que esse óleo essencial possui efeitos interessantes na musculatura lisa de traquéias isoladas, confirmando assim sua utilização popular. Na realidade, algumas plantas aromáticas, encontradas com maior freqüência em nossa região, têm demonstrado atividades farmacológicas coerentes com seu uso em medicina popular (LEAL CARDOSO; FONTELES, 1999).
Os trabalhos científicos a respeito do óleo essencial de Ocimum
micranthum são extremamente escassos na literatura, e o presente estudo é o
primeiro a relatar seus efeitos na musculatura lisa traqueal. Utilizamos como metodologia a confecção de diversas curvas concentrações-efeito com protocolos diferentes no intuito de demonstrar e tentar traçar, pelo menos em parte, o perfil farmacológico deste óleo essencial e seu componente majoritário, o cinamato de metila.
Ao utilizamos o OEOM nas concentrações de 1 – 1000 µg/mL, pudemos evidenciar que o mesmo não provoca alterações no tônus basal de traquéia isolada de rato. Essa característica difere de outros óleos essenciais de plantas do gênero Ocimum, que possuem propriedades miorrelaxantes, inclusive sobre o tônus basal, como o Ocimum gratissimum (MADEIRA et al., 2002). Estas respostas discrepantes se devem ao fato de que os óleos essenciais são constituídos de complexas associações de componentes, pertencentes a diversos grupos químicos, como fenóis e terpenos (MAGALHÃES, 2002) e as quantidades destes componentes podem variar enormemente. Trabalhos mostram que as
estações do ano, o tipo de solo, clima e até mesmo a hora da coleta podem influenciar na composição dos óleos essenciais obtidos de uma mesma espécie (CARVALHO FILHO et al., 2006; ROSAS et al., 2004; VIÑA; MURRILO, 2003; MURAKAMI et al., 2006).
Apesar do óleo essencial de Ocimum micranthum não relaxar o tônus basal da musculatura lisa de traquéias isoladas, ele mostra efeitos interessantes nas contrações induzida por outras substâncias. Pudemos observar que o OEOM foi capaz de reverter completamente a contração já estabelecida e induzida por cloreto de potássio, bem como por CCh, na musculatura lisa de traquéias isoladas de ratos Wistar. Quando o OEOM é adicionado antes do agente contraturante também evidenciamos seus efeitos antiespasmódicos.
. Usando o KCl como agente contrátil, foi possível evidenciar que a resposta máxima (Emax) do tecido foi diminuída pelo uso da concentração de 100 µg/mL do OEOM. Está descrito na literatura que o K+ pode induzir um acoplamento excitação-contração através de um aumento na concentração intracelular de Ca2+, a
partir de um influxo do meio extracelular, por meio da ativação de canais de Ca2+
operados por voltagem (VOCC – Voltage Opereted Calcium Channels) (SPEDDING, 1984; BASTOS et al., 2009).
As respostas observadas nos protocolos anteriormente citados, em que foi utilizado o KCl como agente contraturante, nos levam a crer que o óleo essencial de Ocimum micranthum possivelmente age, pelo menos em parte, interferindo na abertura dos canais de cálcio operados por voltagem (VOCC), visto que o OEOM foi capaz tanto de bloquear como reverter a resposta induzida por cloreto de potássio na musculatura de traquéias de ratos.
Ao utilizarmos o óleo essencial de Ocimum micranthum na contração induzida por carbacol obtivemos respostas diferentes de acordo com o protocolo utilizado. O carbacol é um agonista colinérgico e age de maneira semelhante à acetilcolina. Na membrana plasmática de células musculaturas lisas, este agonista pode ligar-se a receptores específicos que estão acoplados à proteína G e assim desencadear uma série de eventos celulares que aumentam a concentração intracelular de cálcio e podem resultar em contração muscular.
Em um protocolo onde a curva concentração-efeito para o óleo essencial de Ocimum micranthum foi iniciada depois da estabilização da contração induzida por carbacol, pudemos evidenciar que houve uma reversão dessa resposta pelo
óleo. No entanto em outro protocolo onde o óleo essencial foi adicionado, juntamente com nitrendipina, antes do início da CCE para o carbacol o mesmo resultado não ocorreu. Neste último protocolo, não houve diferença estatisticamente significante entre as curvas concentração efeito para o CCh na ausência e presença de 30 e 100µg/mL de OEOM. A nitrendipina é um bloqueador dos canais de cálcio, mais especificamente dos VOCC (DU et al., 2010). A finalidade da utilização da mesma neste protocolo foi de tentar excluir a participação dos VOCC e filtrar a contração muscular induzida pelo carbacol via canais de cálcio operados por receptor (ROCC). Desta maneira possíveis alterações provocadas pelo OEOM poderiam ser atribuídas a uma ação em ROCC, o que não foi o caso.
Como o óleo essencial de Ocimum micranthum é utilizado em muitas doenças respiratórias como asma e bronquites, tentamos mimetizar estas condições em um grupo de animais do nosso estudo. Em um modelo desenvolvido por Weinreich e Undem (1987), onde a ovalbumina é o antígeno desencadeador da sensibilização, condições como hiperreatividade brônquica, aumento da secreção no trato respiratório, dificuldade ventilatória podem ser observadas nestes animais.
Os animais sensibilizados foram divididos em dois grupos; os que inalaram apenas solução fisiológica e os que inalaram uma solução contendo ovalbumina. Neste último caso, estes animais são denominados como desafiados e esse desafio mimetiza condições encontradas em uma crise asmática. O procedimento de broncoprovocação, pela repetição da exposição ao antígeno por inalação ao animal sensibilizado, provoca o desencadeamento de uma resposta bronconstritora (MANZOLLI et al., 1999).
Pudemos observar que o OEOM praticamente não teve efeito na CCE do CCh em animais sensibilizados mas, interessantemente, produziu efeitos significativos em tecidos de animais desafiados pela OVA. Nestes, o OEOM foi capaz de alterar os valores de CE50 nas CCE para o carbacol, indicando que nos
tecidos dos animais desafiados, ele se comporta como um antagonista competitivo, uma vez que houve apenas deslocamento da curva para a direita sem redução de seu efeito máximo
O OEOM se mostrou mais efetivo no bloqueio dos VOCC visto que ele foi capaz tanto de reverter como bloquear a resposta contrátil induzida por KCl. Esta aparente seletividade pode explicar sua maior interferência na curva concentração- efeito do CCh em animais desafiados. Em condições normais a participação destes
canais é mínima na contração induzida por este tipo de agonista (carbacol). No entanto em condições patológicas, como na hiperreatividade, a participação dos canais de cálcio operados por voltagem é marcante (MOURA, 2004) possibilitando assim uma ação mais efetiva do óleo essencial de Ocimum micranthum..
Ao contrário do que foi observado nas CCE para o carbacol, evidenciamos diferenças significativas no efeito máximo induzido pelo KCl na presença de OEOM, tanto em animais apenas sensibilizados como também em tecidos de animais sensibilizados e desafiados. Por outro lado, não foram detectados alterações na sensibilidade do KCl uma vez que os valores de CE50 não
apresentaram diferença significativa.
Após a investigação dos efeitos do óleo essencial de Ocimum
micranthum na musculatura lisa de traquéias isoladas de ratos, decidimos por
investigar a ação do seu principal constituinte, o cinamato de metila. Esta substância está presente em diversos óleos essenciais das plantas aromáticas (BALLABENI et
al., 2010; MURAKAMI et al., 2009; ZHELJAZKOV; CALLAHAN; CANTRELL, 2008).
Primeiramente utilizamos o cinamato de metila nas concentrações de 1 a 1000 µg/mL sob o tônus basal de traquéias isoladas (figura 5a). Pudemos observar que assim como o óleo essencial de Ocimum micranthum, o seu constituinte majoritário, o cinamato de metila, não altera o tônus basal.
Em um segundo protocolo utilizando esta substância, testamos sua ação no estado de contração sustentada na musculatura lisa de traquéias de ratos pelo cloreto de potássio (60 mM). Assim, o cinamato de metila conseguiu reverter de maneira concentração-dependente a contração induzida por KCl . Este fato também foi observado em um outro protocolo na contração induzida por CCh.
Ao contrário do OEOM que agiu com potências semelhantes na reversão da resposta contrátil para o KCl e CCh, com CI50 de 112,9 e 128,2 µg/mL
respectivamente, o cinamato de metila apresentou diferenças nestas concentrações. Na reversão da resposta induzida por KCl a CI50 do cinamato foi de 308,48 µg/mL
enquanto que na reversão da contração provocada por CCh, foi de 100,4 µg/mL. Estes resultados são interessantes, visto que apesar do cinamato de metila ser o constituinte majoritário do OEOM, suas ações podem ser diferentes. Isso pode ser explicado por uma provável interferência dos demais constituintes do óleo essencial, como o limoneno, que constitui 12,9% de sua composição.
Em conclusão, o óleo essencial de Ocimum micranthum, não interfere no tônus basal da musculatura lisa de traquéias mas demonstra ser possuidor de efeitos miorelaxantes e antiespasmódicos. Possivelmente estes efeitos, pelo menos em parte, são provenientes de uma ação nos canais operados por voltagem (VOCC), Adicionalmente o OEOM foi capaz de atuar de maneira mais específica no bloqueio da resposta contrátil de animais desafiados. Para o cinamato de metila foi demonstrado que o mesmo também não interfere no tônus basal e é capaz de reverter a resposta contrátil induzida por cloreto de potássio e carbacol, porém estudos mais aprofundados devem ser realizados, no intuito de tentar traçar o perfil farmacológico de seu efeito miorrelaxante.
7 CONCLUSÃO
•O óleo essencial de Ocimum micranthum, assim como o seu principal constituinte cinamato de metila, não altera o tônus basal de traquéias isoladas de ratos;
•O óleo essencial de O. micranthum apresenta atividade miorrelaxante e antiespasmódica;
• O cinamato de metila possui atividade miorrelaxante
•O mecanismo envolvido no efeito miorelaxante e antiespasmódico do óleo essencial de Ocimum micranthum e no efeito miorelaxante do cinamato de metila é, pelo menos em parte, devido preferencialmente a ação nos canais de cálcio operados por voltagem (VOCC).
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