6.1. Sonuçlar
Bu çalışmada biyolojik uygulamalar ile uyumlu olabilecek aktif uca sahip diblok kopolimer sentezi ve sentezlenen yapının protein ve ilaç ile etkileşiminin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle; epoksi ucuna sahip glisidil metakrilat monomeri ile kararlı yapısından dolayı stiren monomeri tercih edilerek diblok kopolimer sentezlenmiştir. Sentez yöntemi olarak hem yüksek kontrol sağlayan hem de biyolojik çalışmalar ile uyumlu olan Atom Transfer Radikalik Polimerizasyonu (ATRP) tercih edilmiştir.
Çalışmanın birinci aşamasında, heterojenlik indisi oldukça düşük polistiren polimerleri ATRP yöntemiyle sentezlenmiş ve daha sonra glisil metakrilat bloğu ile diblok kopolimer oluşturmak üzere makrobaşlatıcısı olarak kullanılmıştır. Sentez şartları çözücü, süre ve başlatıcı değiştirilerek optimize edilmiş ve sentezlenen polimerlerin karakterizasyonu Jel Geçirgenlik Kromatagrafisi, 1H NMR Spektroskopisi
ve IR Spektroskopisi ile yapılmıştır. Polistiren makrobaşlatıcı sentezinde optimize tepkime şartları; çözücü olarak anisol, katalizör sistemi olarak CuBr/PMDETA, başlatıcı olarak 1-fenil etilbromür (1-FeBr) ve uygun sıcaklık değeri 100 °C olarak bulunmuştur. Tablo 5.1’e bakıldığında polistiren makrobaşlatıcıların heterojenlik indisinin 1.03 - 1.07 arasında değiştiği görülmektedir. Bu sonuçlara göre birbiriyle yaklaşık aynı zincir uzunluğuna sahip polimer zincirlerin mükemmel olarak sentezlendiği söylenebilir.
PS-b-PGMA diblok kopolimer sentez şartları optimize edilirken, önce geçiş metali ve halojen çifti için CuBr seçilerek sentez yapılmış fakat sentez işlemi çok yavaş (yaklaşık 18 saat) ilerlediği için daha sonra CuCl denenmiştir ve tepkime hızının dakikalar civarına indiği gözlenmiştir. Aynı sentez anisol çözücü ortamında denenmiş ve daha sonra anisole göre polaritesi daha yüksek olan benzonitril ve DMF kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlarda polar çözücüler ile daha kısa surede aynı verim elde edilmiştir. Fakat benzonitril çok toksik olduğu için sentezlerde genellikle DMF tercih edilmiştir. Sentezin ilk 10 dakikasında diblok kopolimerin polidispersite indisinin 1.10 civarlarında olduğu görülmektedir. Ancak sentezlenen diblok kopolimerler, reaksiyon ortamında 10 dakikadan daha fazla tutulduğunda kontrolün kaybolup polidispersite indisinin arttığı gözlemlenmiştir.
Sentezlenen diblok kopolimerlerin faz ayrılmalarında, PGMA bloğunun molekül ağırlığı yaklaşık PS bloğunun 5 katı olduğu için morfolojinin küresele kaydığı görülmektedir.
Elde edilen farklı molekül ağırlığındaki diblok kopolimerlerden 5, 10, 15, 25, 30, 40 ve 60 mg tartılmış ve tris tampon ile yıkanarak 2 saat boyunca İnsan serum albümin proteini ile tris tampon çözeltisi içinde etkileştirilmiştir. Bağlanma miktarları albümin proteininin içinde bulunan Triptofan ve Tirozin aminoasitlerinden kaynaklı eksitasyon ve emisyon dalga boylarındaki şiddet değişimine karşı çizilen kalibrasyon grafiğinden yola çıkarak spektrofluorometre cihazı ile hesaplanmıştır.
Bağlanma mekanizması olarak proteinin amin ucu ile glisidil metakrilatın epoksi ucunun reaksiyona girdiği düşünülmüştür. En yüksek bağlanmanın D kodlu diblok kopolimere göre sterik engeli az, A ve B kodlu diblok kopolimerlere göre yapısında daha fazla glisidil metakrilat dolayısıyla epoksi grubu bulunduran 33000 g/mol molekül ağırlığına sahip C kodlu diblok kopolimerde gerçekleştiği görülmüştür. Bağlanma aynı zamanda Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile de gözlemlenmiştir. Daha sonra yapılan denemelerde bu sebepten dolayı C kodlu diblok kopolimer kullanılarak; sığır serum albümin, hemoglobin ve globülin proteinlerinin PS-b-PGMA diblok kopolimere bağlanması incelenmiştir. Her bir protein için ayrı ayrı çizilen kalibrasyon grafiklerinden yapılan hesaplamalar sonucu, en yüksek bağlanma hemoglobin proteini tarafından gerçekleşmiştir. Hemoglobin proteini ferroprotoporfirin yapıda olduğu ve bir globin ve dört “hem” den oluştuğu için yüzeye daha iyi bağlanma sağlamıştır.
Donepezil ilaç etken maddenin fluoresans özelliği olmasından dolayı, 325 nm’ de uyarıldığında, 387 nm’ de eksitasyonu görülmektedir. Bu sayede yüzeylerinde insan serum albümin, sığır serum albümin, globülin ve hemoglobin bulunan diblok kopolimerler “Donepezil” ilaç etken maddesi ile DMF ve tris tampon ortamında etkileştirilmiş ve yüzeye bağlanmaları tespit edilmiştir. Bu denemelerde en iyi etkileşimin yüzeyinde globülin bağlı diblok kopolimer ile gerçekleştiği görülmüştür.
6.2. Öneriler
Sentezlenen PS-b-PGMA diblok kopolimerlerin sentezi, farklı başlatıcı ya da geçiş metali halojen çifti kullanılarak ve çalışma ortamları değiştirilerek denenebilir. Elde edilen PS-b-PGMA diblok kopolimeri yapısında aktif epoksi ucu bulundurduğu için DNA bağlanma, membran oluşturma gibi diğer biyolojik uygulamalarda uygun bir materyal haline getirilip çalışılabilir. Ayrıca ilerleyen çalışmalarda sentezlenen BCP polimeri misel çalışmalarına uygun hale getirilerek, misel oluşum şartları optimize edilebilir. İn vitro ya da in vivo ortamda yüzeye bağlanan ilaç için hücrede dağılım çalışmaları yapılıp, dağılım kinetiği incelenebilir.
KAYNAKLAR
Agrawal, S.K., Sanabria-Delong, N., Coburn, J.M., Tew, G.N., Bhatia, S.R., 2006, Novel drug release profiles from micellar solutions of PLA-PEO-PLA triblock copolymers, Journal of Controlled Release, 112, 64-71.
Akçay A., 2008, Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu ile Stiren Esaslı Yeni Makroperoksi Başlatıcı Sentezi ve Karakterizasyonu; Bu Başlatıcı ile Blok ve Graft Kopolimerlerin Eldeleri, Yüksek Lisans Tezi, Karadeniz Teknik Üniversitesi Fen
Bilimleri, Trabzon.
Arica, M.Y., Bayramoglu, G., 2004, Reversible immobilization of tyrosinase onto polyethyleneimine-grafted and Cu(II) chelated poly(HEMA-co-GMA) reactive membranes. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic , 27, 255–265.
Atar N., 2006, Suda Çözünen Polimerlerin Çimento ve Beton Özellikleri Üzerine Etkisinin İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Dumlupınar Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Kütahya.
Ball P., 2000, The self-made tapestry: pattern formation in nature, Journal of Chemical
Education, 77, 450-452.
Battal Y., 2006, Anyonik Polielektrotların Sığır Serum Albümin ile Etkileşiminin Fluoresans Yöntemi ile İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Yıldız Teknik Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü, İstanbul.
Baysal B., 1981, Polimer Kimyası, Cilt-1.
Bayramoğlu G., Karagoz B., Yilmaz M., Bicak N., Arica Y., 2011, Immobilization of catalase via adsorption on poly(styrene-d-glycidylmethacrylate) grafted and tetraethyldiethylenetriamine ligand attached microbeads, Bioresource Technology, 102, 3653–3661.
Brar A.S, Goyal A., 2008, Characterization and optimization of poly(glycidyl methacrylate-co-styrene) synthesized by atom transfer radical polymerization,
European Polymer Journal, 44, 4082–4091
Carlsson N., Borde A., Wölfel S., Åkerman B., Larsson A., 2011, Quantification of protein concentration by the Bradford method in the presence of pharmaceutical polymers, Analytical Biochemistry , 411, 116–121
Chao C. C., Wang T. C., Ho R. M., Georgopanos P., Avgeropoulos A., Thomas E. L., Robust, 2010, Block Copolymer Mask for Nanopatterning Polymer Films, Acs Nano, 4, 2088-2094.
Eren F., 2011, Kontrollü Polimerizasyon Yöntemleri ve Klik tepkimeleri İle Amfifilik Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu, Yüksek Lisans Tezi, Fatih Üniversitesi Fen
Erdoğan T., Hızal G., Tunca U., 2006, A new strategy for the preparation of multiarm star-shaped polystyrene via a combination of atom transfer radical polymerization and cationic ring-opening polymerization, Designed Monomers and Polymers, 9, 393–401 F. E. Alemdaroglu, K. Ding, R. Berger and A. Herrmann, 2006, DNA-Templated Synthesis in Three Dimensions: Introducing a Micellar Scaffold for Organic Reactions,
Angewandte Chemie International Edition, 45, 4206–4210.
Gao Z, Lee D, Kim D, Bae Y., 2005, Doxorubicin loaded pH-sensitive micelle targeting acidic extracellular pH of human ovarian A2780 tumor in mice, Journal of Drug
Targeting, 13, 391-7.
Gürdöl F., Ademoğlu E., 2006, Biyokimya, İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nobel
Tıp Kitapevleri,1.Baskı.
Hoffman, A.S., 2002, Hydrogels for biomedical applications, Advanced Drug Delivery
Review, 54, 3-12.
Hürtürk E., 2011, Laktat Blok Kopolimerlerinden Oluşan Misellere Albümin Yüklenmesi ve Salınımı, Yüksek Lisans Tezi, Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, İstanbul.
Jeong B, Bae YH, Lee DS, Kim SW., 1997, Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems, Nature, 388, 860–862.
Jin Kon Kim., 2006, Block Copolymer Thin Films for New Functional Nanomaterials,
The 3rd Korea-US Nano Forum, Kyungbuk 790-784, Korea.
J. Rodrı´guez-Herna´ndez, F. Che´cot, Y. Gnanou, S. Lecommandoux, 2005, Toward ‘smart’ nano-objects by self-assembly of block copolymers in solution, Progress in
Polymer Science , 30, 691–724.
Kataoka K, Harada A, Nagasaki Y. , 2001, Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization, and biological significance, Advanced Drug Delivery Review, 47, 113–31.
Krishnan R., Srinivasan S.V., 2003, Controlled/“Living” Radical Polymerization of Glycidyl Methacrylate at Ambient Temperature, Macromolecules, 36, 1769-1771
Kul D., 2006, Poli(etilenoksit) Merkezli ve Poli(tert-Bütilakrilat) Kabuklu Yıldız Şekilli Blok Kopolimerlerin Sentezi ve Misel Özelliklerinin İncelenmesi, Doktora Tezi,
Karadeniz Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Trabzon.
Ke Wang, Wei Feng Li, Jian Feng Xing, Kai Dong, Yang Gao, 2012, Preliminary assessment of the safety evaluation of novel pH-sensitive hydrogel, European Journal
of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 82, 332-339
Kwon GS., 2003,Polymeric micelles for delivery of poorly water-soluble compounds,
Li Feng, Ming Ma, Zhe-Fan Yuan, Jing-Yi Huang and Ren-Xi Zhuo, 2011, Novel poly(glycidyl methacrylate-b-propylene oxide-b-glycidyl methacrylate) derivatives with low cytotoxicity and efficient gene delivery, Journal of Bioactive and Compatible
Polymers, 26, 388–404.
Lim HJ., Cho EC., Lee JA., Kim J., 2012, A novel approach for the use of hyaluronic acid-based hydrogel nanoparticles as effective carriers for transdermal delivery systems,
Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 402, 80-87
Matyjaszewski K., 1999, Transition Metal Catalysis in Controlled Radical Polymerization: Atom Transfer Radical Polymerization, Chemistry A European
Journal, 5, 3095-3102.
Matyjaszewski K., 2000, Editor, Controlled/Living Radical Polymerization Progress in ATRP, NMP, and RAFT, ACS Symposium Series, 768, 138-151, New Orleans.
Matyjaszewski K., Jo S.M., Paik H.J., Shipp D.A., 1999, An Investigation into the CuX/2,2'-Bipyridine (X = Br or Cl) Mediated Atom Transfer Radical Polymerization of Acrylonitrile, Macromolecules, 32, 6431-6438.
Matyjaszewski, K.; 1998, Editor, Controlled Radical Polymerization, ACS Symposium
Series,. 685, San Francisco.
Matyjaszewski, K., Wang, J. -L., Grimaud, T. and Shipp, D. A., 1998, Controlled/"Living" Atom Transfer Radical Polymerization of Methyl Methacrylate Using Various Initiation Systems, Macromolecules, 31, 1527-1534.
Matyjaszewski, K., Wei, M., Xia, J. ve Gaynor, S. G., 1998, Atom Transfer Radical Polymerization of Styrene Catalyzed by Copper Carboxylate Complexes,
Macromolecular Chemistry and Physics, 199, 2289-2292.
Matyjaszewski, K.and Xia, J., 2001, Atom Transfer Radical Polymerization, Chemical
Reviews, 101, 2921-2990.
Özcan Y., 2008, Çevresel Etkilere Duyarlı Blok Kopolimerlerinin Yapılarının SAXS Yöntem ile İncelenmesi, Doktora Tezi, Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Paris R., Fuente L., 2008a, Synthesis of epoxy functionalized four-armed star diblock copolymers by atom transfer radical polymerization, Reactive & Functional Polymers 68, 1004–1012.
Paris R., Mosquera B., Fuente L., 2008b, Atom transfer radical copolymerization of glycidyl methacrylate and allyl methacrylate, two functional monomers, European
Polymer Journal, 44, 2920–2926.
Pallu S., Rochefort G. Y., Jaffre C., Refregiers M., Maurel D.B., Benaitreau D., Lespessailles E., Jamme F., Chappard C., Benhamou C.L., 2012, Synchrotron Ultraviolet Microspectroscopy on Rat Cortical Bone: Involvement of Tyrosine and Tryptophan in the Osteocyte and Its Environment, Plos One, 7,43930.
Patricia A. Zunszain, Jamie Ghuman, Teruyuki Komatsu, Eishun Tsuchida and Stephen Curry, 2003, Crystal structural analysis of human serum albümin complexed with hemin and fatty acid, BMC Structural Biology, 3,6.
Qui, Y. and Park, K., 2001, Environment-sensitive hydrogels for drug delivery,
Advanced Drug Delivery Reviews, 53, 321-339.
Saçak M., 2006, Polimer Kimyası, Gazi Kitapevi, 3.Baskı.
S.B. Darling., 2007, Directing the self-assembly of block copolymers, Progress in
Polymer Science, 32, 1152–1204.
Siegwart D., Kwon Oh J., Matyjaszewski K., 2012, ATRP in the design of functional materials for biomedical applications, Progress in Polymer Science 37, 18– 37.
Taktak F., 2009, Yeni Tip Yüzey Aktif Triblok Kopolimerlerin Sentezi, Karakterizasyonu, Çözelti Davranışlarının İncelenmesi ve Hidrojel Eldesinde Kullanılmaları, Doktora Tezi, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Eskişehir.
Torchilin VP., 2005, Block copolymer micelles as a solution for drug delivery problems, Expert Opin Therapeut Patents; 15, 63–75.
Tüzün C.; 2002, Biyokimya, Palme Yayıncılık, 4.Baskı.
Tyrrell L.Z, Shen Y., Radosza M., 2010, Fabrication of micellar nanoparticles for drug delivery through the self-assembly of block copolymers, Progress in Polymer Science, 35, 1128–1143
Wenwen Wang, Qiuyu Zhang, 2012, Synthesis of block copolymer poly (n-butyl acrylate)-b-polystyrene by DPE seeded emulsion polymerization with monodisperse latex particles and morphology of self-assembly film surface, Journal of Colloid and
Interface Science, 374, 54–60.
Xu P, 2006, Van Kirk E, Li S, Murdoch W, Ren J, Hussain M, Radosz M, Shen Y. Highly stable core-surface-crosslinked nanoparticles as cisplatin carriers, Colliods and
Surfaces B: Biointerfaces, 48, 50–57.
Xue JG., Rand BP., Uchida S., Forrest SR., 2005, A hybrid planar-mixed molecular heterojunction photovoltaic cell, Advanced Materials, 17, 66-71.
Yeşilyurt N., 2007, Fırça Tipi Poli(3-Hidroksialkanoat)-g-Polimetilmetakrilat Graft Kopolimerlerin Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu Yöntemi ile Sentezi ve Karakterizasyonu, Bilim Uzmanlığı Tezi, Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü, Zonguldak.
Yorulmaz E., 2009, Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu ile Glisidil Metakrilat Bazlı ABA Tipi Triblok Kopolimerlerin Sentez ve Karakterizasyonu, Yüksek Lisans Tezi, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Eskişehir.
Zhang, X.Z., Lewis, P.J., Chu C.C., 2005, Fabrication and characterization of a smart drug delivery system: Microsphere in hydrogel, Biomaterials, 26, 3299–3309.
Web Sayfası Kaynak Listesi:
[1]http://megep.meb.gov.tr/mte_program_modul/modul_pdf/543M00004.pdf [2]http://en.wikipedia.org/wiki/Protein [3]http://80.251.40.59/veterinary.ankara.edu.tr/fidanci/Ders_Notlari/Ders_Notlari/ Aminoasitler.html [4]http://en.wikipedia.org/wiki/Human_serum_albumin [5]http://tr.wikipedia.org/wiki/Alb%C3%BCmin [6]http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin [7]http://home.anadolu.edu.tr/~bbozan/bio2012/2012/3.immobilizeenzimler%20 %202012.pdf [8]http://www.ic.kmutnb.ac.th/wpr/webpage/Current%20semester%20(Lecture%20and %20Lab)/PolymerChem/4%20Ionic%20polzn%20(050552).pdf [9] http://taner.balikesir.edu.tr/dersler/polimer_kimyasi/ [10]http://www.polimernedir.com/polimer-kimyasi/kontrollu-polimerizasyon- mekanizmalari/atom-transfer-radikal-polimerlesmesi-atrp/
EKLER 4000,0 3000 2000 1500 1000 650,0 60,0 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98,4 cm-1 % T 2933,12 1725,56 1484,38 1449,98 1388,00 1254,75 1147,70 992,69 905,90 844,75 758,44 698,73
Şekil 6.1. BCP-1 e ait PS-b-PGMA diblok kopolimerin FT-IR spektrumu Date: 27 Haziran 2012 Çarþamba
4000,0 3000 2000 1500 1000 650,0 50,0 55 60 65 70 75 80 85 90 96,3 cm-1 % T 3025,76 2924,60 1727,06 1601,40 1492,65 1451,84 1254,93 1148,28 992,31 906,07 842,69 755,39 696,93
4000,0 3000 2000 1500 1000 650,0 70,0 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 97,4 cm-1 % T 2930,80 1724,26 1450,74 1253,75 1147,15 991,78 905,03 843,10 756,75 697,97
Şekil 6.3. BCP-3 e ait PS-b-PGMA diblok kopolimerin FT-IR spektrumu
Şekil 6.4. BCP-4 e ait PS-b-PGMA diblok kopolimerin 10. ve 90. dakikalarda alınan GPC kromatogramları
Şekil 6.5. BCP-4 e ait PS-b-PGMA diblok kopolimerin 30., 60., 10. ve 90. dakikalarda alınan GPC kromatogramları
Şekil 6.7. Hemoglobin proteinin kalibrasyon grafiği
ÖZGEÇMİŞ
KİŞİSEL BİLGİLER
Adı Soyadı : Leman BUZOĞLU
Uyruğu : T.C.
Doğum Yeri ve Tarihi : İZMİR 22.11.1988
Telefon : 0532 344 52 94
Faks : 0332 241 24 99
e-mail : lemanbuzolu@gmail.com EĞİTİM
Derece Adı, İlçe, İl Bitirme Yılı
Üniversite : Ege Üniversitesi, Bornova, İZMİR 2010 Yüksek Lisans : Selçuk Üniversitesi, Selçuklu, KONYA 2012 Doktora : -
UZMANLIK ALANI Polimer Sentezi YABANCI DİLLER İngilizce