Para a construção da biblioteca genômica enriquecida com locos microssatélites foi utilizado o protocolo descrito por Billotte et al. (1999), com modificações (Figura 5), conforme descrição a seguir:
5.3.2.1. Digestão do DNA
O DNA de um genótipo de L. ericoides, escolhido aleatoriamente, foi digerido para gerar fragmentos de tamanhos adequados. Aproximadamente 5μg de DNA genômico foram digeridos pela enzima Afa I (Invitrogen - 10 U/μL). A digestão foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1,2% por 1,5 h a 60 V.
5.3.2.2. Ligação dos adaptadores
Com o objetivo de aumentar o número de cópias dos fragmentos genômicos, os adaptadores Afa21 (5´-CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA-3´) e Afa25 (5´- TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A-3´) (Integrated DNA Technologies, Inc.) foram ligados ao produto da digestão a fim de garantir que todos os fragmentos tivessem uma terminação comum e conhecida.
5.3.2.3. Pré-amplificação via PCR e purificação
Após a ligação aos adaptadores, foi realizada uma etapa de pré- amplificação, visando gerar maior quantidade de fragmentos que foram ligados aos adaptadores. Os fragmentos digeridos foram submetidos a uma PCR utilizando como primer um dos adaptadores, o Afa21. Após a ligação, os fragmentos foram amplificados, sendo estes purificados utilizando o “Quiaquick PCR purification kit” (QIAGEN Cat. # 28104).
5.3.2.4. Seleção dos fragmentos contendo microssatélites
Após a purificação, foi realizada uma etapa de seleção de fragmentos contendo sequências microssatélites, utilizando sondas biotinoladas, Biotina-IIIII (CT)8 e Biotina-IIIII
(GT)8, complementares às sequências repetitivas GA e CA, e recuperados pela Streptavidin
MagneSphere Paramagnetic Particles (Promega), de acordo com o fabricante. Os fragmentos contendo SSR foram recuperados, após magnetização, por meio de lavagens
das microesferas em SSC 0,1X, em 250 ȝL de água milli-Q (Marca Elga - Purelab Ultra- Modelo: Ultrapuro MK2 - Grau de pureza - 18.2 MW-cm) e armazenado a -20ºC.
5.3.2.5. Amplificação dos fragmentos selecionados via PCR
O número de cópias dos fragmentos selecionados foi amplificado via PCR, utilizando como primer o adaptador Afa21. A reação foi realizada em termociclador BIORAD PTC-100 Peltier, O produto da reação foi analisado por meio de eletroforese em gel de agarose 1%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen).
5.3.2.6. Clonagem em vetor pGEM-T e transformação em células supercompetentes
Os fragmentos amplificados foram clonados empGEM-T Easy Vector System (Promega), segundo o protocolo fornecido com o vetor plasmidial e foram transformados em células XL1-Blue competentes.
As colônias brancas (clones transformados) foram isoladas com palitos estéreis e transferidas para meio 2YT-HMFM líquido com 100 ȝg mL-1 de ampicilina em
placas do tipo ELISA, fechada com adesivo (ABgene) com furos para aeração. Os clones foram incubados a 37ºC por 18h e em seguida, armazenados em ultrafreezer a -80ºC, devidamente identificados.
5.3.2.7. Manutenção dos clones
Para garantir que cada construção (vetor + fragmento) fosse mantida em condições apropriadas para análise posterior, foram utilizadas placas ELISA com fundo em U, com 80μL de meio LB contendo ampicilina (100μg/mL) por poço. As colônias brancas foram repicadas com a ajuda de palitos estéreis e as placas incubadas a 37°C overnight em estufa para o crescimento de colônias. Após esse período, as placas foram armazenadas em freezer -20°C por 30 minutos, e, então, transferidas para ultrafreezer -80°C com glicerol 50%.
5.3.2.8. Seleção e sequenciamento dos clones positivos 5.3.2.8.1. Amplificação dos insertos clonados
Com o objetivo de identificar os clones contendo microssatélites e verificar a eficiência do procedimento de enriquecimento e clonagem, foi realizada uma reação de amplificação dos insertos diretamente das colônias obtidas na etapa anterior, utilizando o primer Afa21. Colônias individuais foram transferidas com um palito estéril para o tubo de PCR contendo 30,5 μ L de água milliQ autoclavada. Esta suspensão de células foi utilizada em uma reação com volume final de 45,0μL. Para controle, 10 μL do volume da reação foram utilizados na eletroforese em gel de agarose 1,5%.
5.3.2.8.2. Inoculação e extração plasmidial
Com o objetivo de isolar o DNA plasmidial das colônias recombinantes, para posterior sequenciamento, foi colocado 1 mL de meio LB líquido contendo 100 ȝg mL-1 de ampicilina em placa com 96 canaletas de poço fundo (ABgene), a
37ºC por 22 h sob agitação a 300 rpm (G24 Environmental Incubator Shaker). A placa, com as suspensões bacterianas, foi centrifugada a 3.000 rpm por 6 min. O sobrenadante foi descartado e 240 ȝL de GTE (0,92% glicose, 26 mM Tris-HCl - pH 7,4, 10 mM EDTA pH 8) foram adicionados a cada poço, a placa foi agitada em vortex por 2 min. Após centrifugação a 4.000 rpm por 6 min, o sobrenadante foi descartado.
Foram adicionados 80 ȝL de GTE ao precipitado e agitado em vortex por 5 min, 60 ȝL da suspensão foi transferida para placa ELISA (Costar) contendo 5 ȝL de RNAse 10 mg mL-1 (Ribonuclease A, Sigma) e 60 ȝL de 0,2 mM NaOH-1% SDS por poço. A placa foi misturada por inversão após selagem com adesivo selador (ABgene) e incubada a temperatura ambiente por 10 min. Após spin com rotação máxima de 1.000 rpm, 60 ȝL acetato de potássio 3 M gelado foram adicionados a cada poço e a placa misturada por inversão devidamente selada, e incubada a 90ºC por 30 min. A placa, após esfriar no gelo por 10 min, foi centrifugada a 4.000 rpm por 4 min. O sobrenadante foi transferido para filtro (placa filtro, Millipore) acoplado a placa com fita adesiva e centrifugado a 4.000 rpm por 4 min a 20ºC. Ao filtrado foram adicionados 110 ȝL de isopropanol. A placa foi misturada por inversão com adesivo selador (ABgene) e centrifugada a 4.000 rpm por 45 min a 20ºC. O sobrenadante foi descartado cuidadosamente e cada precipitado lavado com 180 ȝL de etanol
70% gelado, seguido de centrifugação a 4.000 rpm por 5 min a 20ºC. Após descarte do sobrenadante, os precipitados secaram em temperatura ambiente e foram ressuspendidos em 60 ȝL de água milli-Q. A qualidade da extração plasmidial foi verificada em eletroforese em gel de agarose 0,8%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen), com marcador de peso molecular de 100bp (Fermentas Life Science).
5.3.2.8.3. Sequênciamento
A reação da PCR para sequênciamento foi realizada com 2ȝL de tampão Save Money (5 mM MgCl2, 200 mM Tris-HCl, pH 9), 5 pM iniciador SP6 (5´CATACGATT
TAGGTGACACTATAG 3´), 2 ȝL da extração plasmidial e 0,4 ȝL de BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) em volume final de 10 ȝL. O programa apresentou desnaturação inicial a 96ºC por 2min; 26 ciclos 96ºC por 45s, 50ºC por 30s e 60ºC por 4min. A reação foi purificada antes do sequenciamento, em cada poço da placa foram adicionados 80μL de isopropanol 65%.
A placa foi deixada em repouso, ao abrigo da luz, por 15min, e então centrifugada a 4.000rpm por 45min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 200μL de etanol 70% e seco em temperatura ambiente, em local protegido da luz, por 1h. O DNA foi ressuspendido em 4μL de formamida deionizada (Hi-Di, Applied Biosystems). Antes do sequenciamento, as amostras foram desnaturadas em termociclador, a 90ºC por 3 minutos, e colocadas sobre gelo por 5 minutos.
A placa foi embalada em papel alumínio e enviada para sequenciamento em sequenciador automático capilar 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) no Centro APTA Citros Sylvio Moreira, Cordeiropólis, São Paulo. As sequências obtidas foram processadas pelo Software 3730/3730 xl Data Collection versão 3.0 (Applied Biosystems).
Figura 5. Esquema representativo das etapas da construção da biblioteca enriquecida com microssatélites (NUCCI, 2007).
5.3.2.9. Identificação e desenho dos motivos microssatélites
Após a seleção das sequências, realizadas pelos programas Chromas versão 2.33 (Technelysium) e BioEdit versão 7.0.9.0 (HALL, 1999), estas foram transformadas em formato “FASTA” com o programa BioEdit.
Os trechos relativos ao vetor e aos adaptadores (Afa21 e Afa25) foram eliminados, e em seguida as sequências SSR foram identificadas pelo programa Websat (MARTINS et al., 2009). Os parâmetros utilizados para a identificação de microssatélites foram os seguintes: microssatélites compostos por motivos dinucleotídeos que devem ter no mínimo sete repetições do motivo, microssatélites compostos por motivos trinucleotídeos que devem ter no mínimo cinco repetições do motivo e microssatélites compostos por motivos tetranucleotídeos (ou mais) que deveriam ter no mínimo três repetições do motivo.
O desenho dos primer foi realizado no programa Primer3 (ROZEN e SKALETSKY, 1999). Os parâmetros foram configurados de forma a que o produto de
amplificação tenha no mínimo 100 e no máximo 250 pb e a porcentagem de GC deve estar no intervalo de 40 a 60%.
A probabilidade de formação de estruturas secundárias (hairpins e loops) e a qualidade de cada par de primers obtido foi verificada no software Gene Runner v. 3.1.
5.3.2.10. Caracterização e genotipagem dos microssatélites
Foram testados 21 pares de primers desenvolvidos para a espécie L. ericoides, para a avaliação do polimorfismo das populações de L. ericoides (P1, P2 e P3) e das populações de L. pinaster (P4 e P5).
A otimização das condições ideais de amplificação para cada primer, foram realizadas utilizando dois indivíduos de cada população, várias reações de PCR, foram realizadas, variando as condições de temperatura de anelamento (48 a 62ºC), quantidade de DNA (1,0 a 5,0ng), concentração de cada primer (0,16 a 2,0μM), de DNTP (0,2 a 1,0mM) e de MgCl2 (1,2 a 2,0μM), seguindo a programação demonstrada na Tabela 2.
Tabela 2. Programação da reação de PCR para a amplificação dos primers de L. ericoides
Etapa Temperatura Tempo (min.)
1 94ºC 2 2 94ºC 1 3 TAºC* 1 4 72ºC 1 5 (32 a 40) vezes etapas 2 a 4 6 72ºC 10 7 15ºC
*TA - temperatura de anelamento