Neste capítulo são descritos as estratégias utilizadas para a recuperação e purificação dos biossurfactantes obtidos. As técnicas empregadas, neste estudo, foram sugeridas pela literatura e consistiu em ensaios de precipitação ácida, extração com solvente e adsorção em batelada e em leito fixo.
3.1 - Microrganismo
Para os ensaios utilizou-se uma cepa de Pseudomonas aeruginosa AP 029/GLVIIA isolada de poço de petróleo pertencente à UFRN e a UNRN/CE guardadas na coleção de culturas do Departamento de Antibióticos da UFPE. A cultura foi mantida em meio sólido inclinado com PCA e 25% de Agar-agar, sendo a renovação das células feita por repique das células no meio e incubação à 38ºC durante 48 horas. Após a incubação a cepa é mantida a 5 °C (Lobato, 2003).
3.2 - Obtenção do Inóculo
Para a obtenção do inóculo, 3 Erlenmeyers de 250 mL, com volume de meio de 100 mL, concentração de melaço de 3% (m/v) e 0,3% (m/v) de NaNO3 lacrados, foram
esterilizados em autoclave à 121ºC por 15 minutos. Os frascos depois de esterilizados e resfriados a temperatura ambiente foram levados à câmara de fluxo laminar, onde alçadas de células oriundas do meio de manutenção eram transferidas assepticamente para os frascos contendo o meio de cultura. Os frascos foram colocados em incubador rotatório (shaker) a 38ºC, por 10 horas, sob agitação de 200 rpm, sendo esta cultura utilizada como inóculo nos ensaios para produção de biossurfactantes. O valor da agitação foi escolhido com base nos estudos realizados por Bezerra (2006), onde observou que essa agitação favorece a conversão
exponencial. substrato em células, e que no período de 10 horas as células estariam em plena fase exponencial.
3.3 - Cultivo
Esta etapa teve como objetivo obter caldo fermentado para o estudo da recuperação e purificação do biossurfactante. A Figura 3.1 apresenta o desenho esquemático da produção do biosurfactante. No cultivo foram utilizados 30 Erlenmeyers de 250 mL com volume de meio de 93 mL, concentração de melaço de 3% (m/v), 0,3% (m/v) de NaNO3e razão de aeração 0,4
(Vmeio/Vfrasco) que foram lacrados e esterilizados em autoclave a 121 °C por 15 minutos. Os
frascos foram inoculados na câmara de fluxo laminar, com 7% (v/v) do inóculo e em seguida levados ao incubador rotatório (shaker) a 100 rpm e 38 °C, por 96 horas de cultivo, de acordo com os melhores resultados obtidos por Bezerra (2006), que observou que essa agitação favorece a produção do biossurfactante. O caldo produzido foi centrifugado para retirada das células e colocado em frascos de vidro e armazenado a 4 ºC para posterior análise.
Figura 3.1- Desenho esquemático da produção do biossurfactante.
exponencial. substrato em células, e que no período de 10 horas as células estariam em plena fase exponencial.
3.3 - Cultivo
Esta etapa teve como objetivo obter caldo fermentado para o estudo da recuperação e purificação do biossurfactante. A Figura 3.1 apresenta o desenho esquemático da produção do biosurfactante. No cultivo foram utilizados 30 Erlenmeyers de 250 mL com volume de meio de 93 mL, concentração de melaço de 3% (m/v), 0,3% (m/v) de NaNO3e razão de aeração 0,4
(Vmeio/Vfrasco) que foram lacrados e esterilizados em autoclave a 121 °C por 15 minutos. Os
frascos foram inoculados na câmara de fluxo laminar, com 7% (v/v) do inóculo e em seguida levados ao incubador rotatório (shaker) a 100 rpm e 38 °C, por 96 horas de cultivo, de acordo com os melhores resultados obtidos por Bezerra (2006), que observou que essa agitação favorece a produção do biossurfactante. O caldo produzido foi centrifugado para retirada das células e colocado em frascos de vidro e armazenado a 4 ºC para posterior análise.
Figura 3.1- Desenho esquemático da produção do biossurfactante.
exponencial. substrato em células, e que no período de 10 horas as células estariam em plena fase exponencial.
3.3 - Cultivo
Esta etapa teve como objetivo obter caldo fermentado para o estudo da recuperação e purificação do biossurfactante. A Figura 3.1 apresenta o desenho esquemático da produção do biosurfactante. No cultivo foram utilizados 30 Erlenmeyers de 250 mL com volume de meio de 93 mL, concentração de melaço de 3% (m/v), 0,3% (m/v) de NaNO3e razão de aeração 0,4
(Vmeio/Vfrasco) que foram lacrados e esterilizados em autoclave a 121 °C por 15 minutos. Os
frascos foram inoculados na câmara de fluxo laminar, com 7% (v/v) do inóculo e em seguida levados ao incubador rotatório (shaker) a 100 rpm e 38 °C, por 96 horas de cultivo, de acordo com os melhores resultados obtidos por Bezerra (2006), que observou que essa agitação favorece a produção do biossurfactante. O caldo produzido foi centrifugado para retirada das células e colocado em frascos de vidro e armazenado a 4 ºC para posterior análise.
3.4 - Recuperação e Purificação dos ramnolipídeos
A Figura 3.2 ilustra o fluxograma geral utilizado no processo de recuperação e purificação dos ramnolipídeos.
Caldo Bruto Centrifugação Acidificação Armazenamento (T = 4 ºC) Overnight Centrifugação Biomassa Sobrenadante I (Caldo livre de células) Centrifugação Sobrenadante II Precipitado Extração
Fase orgância Fase aquosa
Concentração Ressuspensão Quantificação Adsorção Quantificação Identificação
3.4.1 - Centrifugação
Após o cultivo, o caldo fermentado foi centrifugado por 15 minutos a uma velocidade de centrifugação de 3700 rpm, para remoção da biomassa. O sobrenadante I obtido foi colocado em frascos de vidro e guardado sob refrigeração a 4 ºC para posterior estudos de recuperação e purificação.
3.4.2 - Precipitação ácida
De acordo com a literatura, a precipitação ácida é a primeira etapa no processo de recuperação e purificação de biossurfactantes. Os ácidos mais utilizados são o ácido clorídrico (HCl) e o ácido sulfúrico (H2SO4). Nesta etapa, avaliou-se esses dois ácidos para verificar
qual favorece uma maior precipitação do biossurfactante. Para essa avaliação, fez-se um planejamento fatorial 24(planejamento I) com triplicata no ponto central, em que as variáveis estudadas foram: a concentração do ácido (2,0; 4,0 e 6,0 N), o pH do meio (2,0, 2,5 e 3,0), a velocidade de agitação (2000, 3000 e 4000 rpm) e o tempo (10, 15 e 20 min). sendo a massa do precipitado obtido a variável resposta do planejamento. Para esta operação foram utilizados tubos de centrifuga de 50 mL (Falcon) previamente tarados em estufa a 80 ºC por 24 horas e 15 mL de sobrenadante I em cada tubo. Desta forma, o sobrenadante I, sem células, foi acidificado, guardado em geladeira para completar a precipitação por aproximadamente 20 horas (overnight), centrifugado e o sobrenadante II obtido descartado, seguindo o planejamento para cada ácido. A massa de precipitado foi lavada com água destilada por duas vezes para retirar resíduos do sobrenadante. Os tubos foram colocados em estufa a 80 °C por 24 horas e pesados posteriormente. Os experimentos foram realizados em duplicata e o valor da massa foi obtido por diferença sendo considerado o valor médio (Sim et al, 1997; Siddhartha et al, 2006; Mata-Sandoval, Karns & Torrents, 1999; Schenk et al, 1995; Rashedi et al, 2005; Patel & Desai, 1997).
A Tabela 3.1 apresenta os fatores e os níveis estudados na precipitação ácida e a Tabela 3.2 mostra a matriz do planejamento I que foi utilizada nos ensaios conforme Barros Neto et al (2006). Como ferramenta para auxiliar na análise do planejamento experimental foi utilizado o programa Statistica 7.0. Os níveis estudados neste planejamento foram obtidos da
literatura, com exceção do tempo e velocidade de agitação que foram escolhidos de acordo com as limitações do equipamento.
Tabela 3.1- Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central (Planejamento I).
Variáveis (-1) Níveis(0) (1)
Concentração do ácido 2 N 4 N 6 N
Tempo de centrifugação 10 min 15 min 20 min
Velocidade de centrifugação 2000 rpm 3000 rpm 4000 rpm
pH 2,0 2,5 3,0
Tabela 3.2 - Matriz do planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central.
Ensaio 1 2 3 4 1 - - - - 2 + - - - 3 - + - - 4 + + - - 5 - - + - 6 + - + - 7 - + + - 8 + + + - 9 - - - + 10 + - - + 11 - + - + 12 + + - + 13 - - + + 14 + - + + 15 - + + + 16 + + + + 17 0 0 0 0 18 0 0 0 0 19 0 0 0 0
Como resultado desta avaliação o HCl obteve os melhores resultados, sendo utilizado na próxima etapa de recuperação e purificação nas seguintes condições: concentração 2N, tempo de centrifugação 10 minutos, velocidade de centrifugação de 2000 rpm e pH 2,0.
3.4.3 - Extração com solvente
Inicialmente, foram feitos ensaios preliminares com clorofórmio e metanol (2:1), sendo esta relação de solventes é a mais utilizada na extração de ramnolipídeos, porém os resultados foram insatisfatórios, pois não conseguiram remover o biossurfactante do meio e as medidas de tensão superficial e quantificação não apresentaram resultados significativos. Uma alternativa foi realizar a extração com o éter de petróleo, visando extrair o ramnolipídeo através de sua porção lipídica. Os resultados destes ensaios preliminares mostraram, através da quantificação e de medidas de tensão superficial, que o éter de petróleo conseguiu extrair melhor os ramnolipídeos, logo os demais ensaios de extração foram realizados com este solvente.
Com as melhores condições obtidas na etapa de precipitação ácida, um volume de aproximadamente 80 mL do sobrenadante sem células foi acidificado a pH 2,0 (HCl 2N) e guardado em geladeira por aproximadamente 20 h (overnight). Após este período o sobrenadante foi centrifugado a 2000 rpm (2205 x g) por 10 minutos. O sobrenadante e o precipitado obtidos da centrifugação foram separados e reservados para posterior extração. O sobrenadante obtido da centrifugação foi colocado em um funil de separação onde se adicionou 80 mL de éter de petróleo (1:1 v/v) para a extração do ramnolipídeo sintetizado. O funil foi agitado vigorosamente e esperaram-se 30 minutos para a separação das fases. Este procedimento foi repetido três vezes para garantir que o máximo de ramnolipídeos fossem extraídos. A cada período, o éter de petróleo contendo o ramnolipídeo era estocado em um béquer para posterior concentração do biossurfactante. Tantos os ensaios como as análises foram realizados em triplicata. Este mesmo procedimento foi realizado com o precipitado obtido após centrifugação. As Figuras 3.3 e 3.3 apresentam o procedimento realizado com o sobrenadante e o precipitado, respectivamente. A Figura 3.5 apresenta a fase orgânica recolhida após extração do sobrenadante e do precipitado.
Figura 3.3 - Extração do sobrenadante com éter de petróleo.
Figura 3.5 - A fase orgânica do sobrenadante (A) e do precipitado (B) após extração com éter de petróleo.
O ramnolipídeo obtido da fase orgânica foi levado ao rotavapor (R 215 – Buchi) para ser concentrado a uma temperatura de 40 ºC. O concentrado obtido foi ressuspenso em 80 mL de água destilada e guardado sob refrigeração. (Sim et al, 1997; Siddhartha et al, 2006; Mata- Sandoval et al, 1999; Schenk et al, 1995; Rashedi et al, 2005; Patel & Desai, 1997). A análise de quantificação do concentrado do sobrenadante e do precipitado mostrou que o ramnolipídeo produzido encontra-se em maior quantidade no sobrenadante, ao contrário da literatura que se utiliza o precipitado na maioria dos estudos de recuperação e purificação. Diante disto, os ensaios seguintes foram realizados com o sobrenadante.
As Figuras 3.6 e 3.7 apresentam a concentração da fase orgânica do sobrenadante e do precipitado, respectivamente, no rotavapor após a extração.
Figura 3.6 - Concentração da fase orgânica do sobrenadante no rotavapor a 40 ºC.
3.4.4 - Adsorção
Para iniciar a etapa de adsorção foram avaliados preliminarmente dois adsorventes: Amberlite XAD-2 e o carvão ativado (CRQ). O primeiro adsorvente é uma resina de poliestireno de interação hidrofóbica mais utilizada nas estratégias de recuperação e purificação de ramnolipídeos, de acordo com a literatura e o segundo tem sido alvo de recentes estudos nesta área. As medidas de tensão superficial foram utilizadas para avaliar a eficiência desses dois adsorventes na adsorção dos ramnolipídeos. Os resultados obtidos indicaram que o carvão ativado teve uma melhor eficiência na adsorção em relação à resina. Logo os ensaios de adsorção foram realizados com o carvão ativado.
3.4.4.1 - Adsorção em batelada
Após a avaliação preliminar dos adsorventes seguiu-se o estudo de adsorção em batelada para avaliar os seguintes parâmetros: pH do meio (3, 6,5 e 10); temperatura (30, 40 e 50ºC), concentração de carvão (1, 2 e 3% m/v), que relaciona a massa de carvão pelo volume do sobrenadante, e agitação (100, 150 e 200 rpm). Para auxiliar nesta avaliação foi realizado um segundo planejamento fatorial 24 (planejamento II). As características do carvão ativado (CRQ – Diadema/SP) utilizado encontram-se apresentadas na Tabela 3.3. Cada ensaio consistiu em submeter 7 Erlenmeyers contendo 15 mL de sobrenadante e carvão ativado sob agitação em agitador rotatório sendo as amostras retiradas nos tempos de 1, 2, 5, 10, 30, 60 e 90 min, seguindo as condições estudadas no planejamento. Os ensaios de adsorção realizados com carvão ativado seguiu a metodologia utilizada por Dubey et al. (2005). A Figura 3.8 apresenta o desenho esquemático dos ensaios de adsorção do biosurfactante neste segundo planejamento experimental.
Tabela 3.3 - Caracteristicas do carvão ativado usado no estudo de adsorção do ramnolipídeo.
Número de Iodo 906 mg I2/g de carvão ativado
pH 6,3
Umidade 4,03 %
Teor de Cinzas 5,1 %
Figura 3.8 - Desenho esquemático dos ensaios de adsorção do biossurfactante.
O planejamento II foi realizado com repetição do ponto central, sendo apresentados na Tabela 3.4 os fatores e os níveis que foram estudados na adsorção. A Tabela 3.5 mostra a matriz do planejamento II que foi utilizada nos ensaios conforme Barros Neto et al (2006). Como ferramenta para auxiliar na análise do planejamento experimental foi utilizado o programa Statistica 7.0.
Tabela 3.4 - Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central (Planejamento II). Fatores +1 Níveis0 -1 pH 3 6,5 10 Temperatura 30 ºC 40 ºC 50 ºC Conc. Carvão (% - p/v) 1% 2% 3% Agitação 100 rpm 150 rpm 200 rpm (30, 40 e 50 ºC) HCl 2N Carvão ativado ( 1, 2 e 3% m/v) (100 – 200 rpm) (1 – 90 min)
Figura 3.8 - Desenho esquemático dos ensaios de adsorção do biossurfactante.
O planejamento II foi realizado com repetição do ponto central, sendo apresentados na Tabela 3.4 os fatores e os níveis que foram estudados na adsorção. A Tabela 3.5 mostra a matriz do planejamento II que foi utilizada nos ensaios conforme Barros Neto et al (2006). Como ferramenta para auxiliar na análise do planejamento experimental foi utilizado o programa Statistica 7.0.
Tabela 3.4 - Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central (Planejamento II). Fatores +1 Níveis0 -1 pH 3 6,5 10 Temperatura 30 ºC 40 ºC 50 ºC Conc. Carvão (% - p/v) 1% 2% 3% Agitação 100 rpm 150 rpm 200 rpm (30, 40 e 50 ºC) HCl 2N Carvão ativado ( 1, 2 e 3% m/v) (100 – 200 rpm) (1 – 90 min)
Figura 3.8 - Desenho esquemático dos ensaios de adsorção do biossurfactante.
O planejamento II foi realizado com repetição do ponto central, sendo apresentados na Tabela 3.4 os fatores e os níveis que foram estudados na adsorção. A Tabela 3.5 mostra a matriz do planejamento II que foi utilizada nos ensaios conforme Barros Neto et al (2006). Como ferramenta para auxiliar na análise do planejamento experimental foi utilizado o programa Statistica 7.0.
Tabela 3.4 - Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central (Planejamento II). Fatores +1 Níveis0 -1 pH 3 6,5 10 Temperatura 30 ºC 40 ºC 50 ºC Conc. Carvão (% - p/v) 1% 2% 3% Agitação 100 rpm 150 rpm 200 rpm (30, 40 e 50 ºC) HCl 2N Carvão ativado ( 1, 2 e 3% m/v) (100 – 200 rpm) (1 – 90 min)
Tabela 3.5 - Matriz do segundo planejamento fatorial 24com triplicata no ponto central. Ensaios Fatores 1 2 3 4 1 -1 -1 -1 -1 2 +1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 5 -1 -1 +1 -1 6 +1 -1 +1 -1 7 -1 +1 +1 -1 8 +1 +1 +1 -1 9 -1 -1 -1 +1 10 +1 -1 -1 +1 11 -1 +1 -1 +1 12 +1 +1 -1 +1 13 -1 -1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 15 -1 +1 +1 +1 16 +1 +1 +1 +1 17 0 0 0 0 18 0 0 0 0 19 0 0 0 0
Com as melhores condições obtidas do planejamento II, foram realizados ensaios de adsorção variando a concentração inicial do caldo bruto para obtenção das curvas da fase líquida e sólida, visando à determinação das isotermas e a adequação aos modelos de Langmuir e Freundlich.
3.4.4.2 - Adsorção em leito fixo
3.4.4.2.1 - Protocolo I: Adsorção com carvão ativado
Dando continuidade aos ensaios de adsorção fez-se um estudo em coluna de leito fixo utilizando os melhores parâmetros obtidos da avaliação do planejamento II. Nesta fase, trabalhou-se com uma altura de leito de 10 cm, área de 5,31 cm2e volume de coluna de 53,10 cm3. O volume da carga (amostra), da lavagem e da eluição foram fixados em 200 mL e o volume do equilíbrio em 265,5 mL (5x o volume da coluna). As velocidades de fluxo na carga, na lavagem e no equilíbrio foram de 200 cm/h e na eluição em 100 cm/h. A coluna foi equilibrada com solução tampão de fosfato de potássio (KH PO e K HPO ) 50 mM a pH 6,5.
O eluente utilizado foi a acetona avaliando-se diferentes concentrações (pura, 25%, 50% e 75%) (Dubey et al., 2005). A Figura 3.9 mostra o aparato utilizado no estudo de adsorção em coluna em leito fixo.
Figura 3.9 - Coluna de leito fixo com carvão ativado.
3.4.4.2.2 - Protocolo II: Efeito combinado com interação hidrofóbica
Após a adsorção com o carvão, estudou-se o efeito com a resina de interação hidrofóbica Streamline Phenyl para uma melhor separação do ramnolipídeo produzido. Essa avaliação foi realizada em microtubos de 2 mL (Eppendorf). A resina (0,5 mL) foi equilibrada com uma solução tampão de fosfato de potássio (KH2PO4e K2HPO4) 50mM a pH 6,5 + NaCl
1M por 15 min. O passante e o eluido (1,5 mL), que já haviam passado pelo carvão, foram postos em contato com a resina por 15 min e em seguida foi feita a eluição com solução tampão de fosfato de potássio a pH 6,5. O eluido final foi levado ao cromatógrafo para sua identificação e quantificação.
3.4.5 - Quantificação de ramnolipídeos
De acordo com a literatura, os métodos colorimétricos são bastante utilizados na quantificação dos ramnolipídeos, que consiste na reação da molécula de ramnose com um composto químico de cor (Heyd et al, 2008). Dentre os métodos colorimétricos utilizados na literatura, foram avaliados, preliminarmente, o método do orcinol, o método utilizando fenol (5%) e ácido sulfúrico e o método do ácido tioglicólico. Todos esses métodos quantificam os ramnolipídeos em termos de ramnose. Utilizando-se de uma cinética, a produção dos ramnolipídeos foi acompanha no tempo pela quantificação realizada por esses métodos. Os resultados obtidos mostraram que o método do ácido tioglicólico melhor representou a produção dos ramnolipídeos na cinética. Pois tanto para o método do orcinol, como para o do fenol e ácido sulfúrico os resultados foram mascarados devido à presença no meio de melaço (sacarose), substrato utilizado como única fonte de carbono.
O biossurfactante produzido foi quantificado pelo método tioglicólico, expresso em ramnose, de acordo com Rahman et al. (2002). O método consiste em adicionar 4,5 mL de ácido sulfúrico diluído (6:1) ao caldo livre de células, agitando vigorosamente por 1 minuto em vórtex. A mistura foi aquecida a 100°C por 10 minutos e esfriada a temperatura ambiente. Depois de esfriada, adicionou-se a mistura, 0,1 mL de solução de ácido tioglicólico 3% recém preparada, agitou-se novamente em vórtex por 1 minuto. A mistura foi guardada em um local sobre ausência de luz por 3h. Absorbância foi medida a 400 e 430 nm utilizando-se o espectofotômetro (Genesis 10UV – Themo Spectronic).
A concentração de ramnose foi determinada a partir da diferença entre os dois comprimentos de onda (400 e 430 nm) usando-se curva de calibração, previamente determinada com ramnose comercial. Efetuou-se a diferença porque o valor de absorbância obtido na leitura de 430 nm indica a interferência de outros açúcares. As medidas foram feitas em triplicata, considerando à média entre elas e o valor obtido foi multiplicado por 3,4, que relaciona o ramnolipídeo em termos de ramnose, segundo Raza et al. (2007).
3.4.6 - Identificação do ramnolipídeo
Para a identificação e/ou separação dos ramnolipídeos homólogos (RL1, RL2, RL 3 e RL 4) foi utilizado a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). O cromatógrafo utilizado foi da marca SHIMADZU, constituído de seis bombas de cromatografia liquida LC- 10ADVP, desgaiseficador modelo DGU-2ª, detector UV-VIS modelo SPD-10AV SHIMADZU, sistema de integração C-R6A SHIMADZU. As amostras foram filtradas em membrana de 0,22 µm e aplicadas na coluna SHIMADZU Shim-pack “CLC(M)” C18 (4,6 mm x 150 mm) em um fluxo de 0,8 mL/min e com volume de amostra de 20 µL. A composição do eluente (acetonitrila/água) foi programado em 30% de acetonitrila por 4 min., 30% a 100% de acetonitrila por 10 min., 100% de acetonitrila por 9 min. e retornando para 30% por 2 min. A cromatografia foi realizada a 25 ºC. As análises foram realizadas utilizando o detector UV-VIS nos comprimentos de onda de 265 a 320 nm . (Schenk et al., 1995).