SONUÇ VE TARTIŞMA

Çalışmamızda Calamintha nepeta subsp. glandulosa bitki türünün metanol, etanol ve petrol eteri ekstrelerinin antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteleri ve HPLC sonuçları incelendi.

Disk difüzyon metodu sonuçları incelendiğinde metanol ve petrol eteri ekstresi tüm bakteriler üzerinde inhibisyon zonu oluştururken, etanol ekstresi P.

vulgaris (10.5±1.29 mm), B. cereus (8.75±0.95 mm), P. aeruginosa (7±0.81 mm), E. coli (24.18±0.5 mm) zon oluşturdu. S. aureus ve K. pneumonia üzerinde inhibisyon

zonu oluşturmadı. Küflerden A. flavus üzerinde sadece petrol eteri ekstresi inhibisyon zonu oluşturdu (6.75±0.95 mm). A. niger üzerinde ise yalnızca etanol ekstresi inhibisyon zonu oluşturdu (6.75±0.5 mm). A. ochraceus ve F. proliferatum üzerine ise üç ekstrede inhibisyon zonu oluşturdu.

Etanol ekstresi E. coli üzerinde metanol ekstresine oranla iki kat, petrol eteri ekstresine oranla ise üç kat daha fazla inhibisyon zonu oluşturdu ( etanol ekstresi: 24.18±0.5 mm, metanol ekstresi: 10.5±0.57 mm, petrol eteri ekstresi: 8±0.81 mm).

Candida albicans mayası ise metanol ekstresinde 6.5±0.57 mm, etanol

ekstresinde 7±0.81 mm, petrol eteri ekstresinde ise 17.5±1.29 mm çapında inhibisyon zonu oluşturdu. En etkili sonuç petrol eteri ekstresinde görüldü.

Mikrodilüsyon metodu sonuçları incelendiğinde metanol ekstresinde E. coli üzerinde bakterisit etki gösterdi (MBK: 12.5 mg/mL). A. ochraseus ve F.

proliferatum üzerinde fungisit (MFK: 12.5 mg/mL) etki gösterdi.

Etanol ekstresi P. vulgaris üzerinde bakterisit etki gösterdi (MBK:12.5 mg/mL). F. proliferatum üzerinde fungisit (MFK:1.6 mg/mL) etki gösterdi.

39

Petrol eteri ekstresi P. vulgaris ve E. coli üzerinde bakterisit etki gösterdi (MBK: 12.5 mg/mL). F. proferilatum üzerinde 1.6 mg/mL ve A. ochraceus üzerinde 6.3 mg/mL konsantrasyon değerinde fungisit etki gösterdi. Candida albicans metanol, etanol ve petrol ekstrelerinde en iyi sonucu petrol eteri ekstresinde 12.5 mg/mL konsantrasyon değerinde inhibisyon gösterdi.

Çizelge 3.12’de verilen fenolik madde analiz sonuçları incelendiğinde metanol ekstresinin chlorogenic asit (1271.6 µg/gram), apigenin-7glucoside (1006.4 µg/gram), rosmarinic acid (7689.7 µg/gram), luteolin (579.1 µg/gram), gallik asit (70.9 µg/gram), caffeic acid (599.7 µg/gram), etanol ekstresinin chlorogenic acid (1080.6 µg/gram), caffeic acid (204.9 µg/gram), syringic (378.4 µg/gram), p- coumaric acid (80.7 µg/gram), gallic acid (134.8 µg/gram), apigenin-7glucoside (849.6 µg/gram), rosmarinic acid (5146.2 µg/gram), luteolin (1032.9 µg/gram), petrol eteri ekstresinde ise çalışılan standartlardan hiçbiri bulunamadı.

Antioksidan çalışmaları DPPH, total fenol miktar tayini ve total flavonoid miktar tayini metodları kullanılarak çalışıldı. DPPH yöntemi, kararlı serbest radikal 2,2-difenilpikrilhidrazil (DPPH.)’in elektron veya hidrojen atomları veren antioksidan kimyasalların varlığında, bu kimyasallar tarafından süpürülmesi (temizlenmesi) ile karakteristik mor renginin açılmasının spektrofotometrik olarak belirlenmesi temeline dayanır [44].

DPPH metoduyla yaptığımız çalışma sonucunda metanol ekstresinin en düşük IC50 değerine sahip olduğu belirlendi. Metanol ekstresinin kontrol grubu olan

askorbik asitten (8,9±0,1 µg/mL) daha düşük değerde (4.78±0.2 µg/mL) IC50 değeri

göstermiş olduğu bulundu. Etanol ekstresi de askorbik aside yakın değerde IC50

değeri gösterdi (10,19±0,1 µg/mL). Bunun sonucunda çalışmamızda metanol ve etanol ekstresinin serbest radikal süpürücü etkisinin yüksek olduğu görüldü. Petrol eteri ekstresinde ise 63,5±1,25 µg/mL konsantrasyonda IC50 değeri görüldü. Böylece

petrol eteri ekstresinin serbest radikal süpürücü etkisinin daha düşük olduğu saptandı. Ekstrelere ait IC50 değerleri çizelge 3.7’de verildi.

40

Metanol, etanol, petrol eteri ekstreleri ve askorbik asit % inhibisyon değerleri karşılaştırıldığında 200 µg/mL konsantrasyonda en iyi değer metanol ekstresinde görüldü. Etanol ekstresi de askorbik aside yakın değerler verdi. Ancak petrol eteri ekstresi askorbik asitten tüm konsantrasyonlarda daha düşük %inhibisyon gösterdi. Buna bağlı olarak petrol eteri ekstresinde anti-radikalik aktivite saptanamadı.

Calamintha incana ile yapılan bir çalışmada DPPH methodu kullanılmış

metanol ekstresinin IC50 değeri 23.1 ± 1.1 µg/ml olarak tespit edilmiştir. Bu sonuç

bizim sonucumuzla kıyaslandığında C. nepeta subsp. glandulosa bitkisinde daha düşük IC50 değeri bulundu. Özütlerin serbest radikal giderim aktivitesinin, özüt

içerisindeki antioksidan bileşiklerin hidrojenlerini verebilmelerine ve bu bileşenlerin yapısal konformasyonuna bağlı olduğu bilinmektedir [45-46]. 517’nm de dalga boyu maksimuma sahip olan DPPH. serbest radikali, kararlı diamagnetik bir molekül olabilmek için antioksidan moleküllerden bir elektron yada hidrojen radikalini kolaylıkla alabilmektedir [47].

Fenoller hidroksil grupları bulundurduklarından, serbest radikalleri yok etme yetenekleri nedeniyle çok önemli bitki bileşenleridir [48]. Aynı zamanda fenolik bileşikler doğrudan doğruya antioksidan aktiviteye katkıda bulunabilirler [49]. Polifenolik bileşikler, potansiyel bir antioksidan olduğu için antioksidan aktivite belirlemede, toplam fenolik madde miktarlarının bilinmesi önemlidir.

Total fenol yöntemi sonuçlarında gallik asit referans madde olarak kullanılıp sonuçlar gr/L ekstrede mg gallik asit eşdeğer miktarı olarak verildi. Ekstreler kıyaslandığında etanol ekstresi fenol bakımından diğer ekstrelerden daha zengindir (187.33 mgGA/gr). Metanol ekstresinde 178.66 mgGA/gr miktarında fenol içerdiği belirlendi. Petrol eteri ekstresinde tespit edilemeyecek kadar az miktarda fenolik madde bulunmaktadır.

Flavonoidler, antioksidatif aktivitelerini ksantin oksidaz, lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi enzimleri inhibe ederek, metal iyonları ile selat olusturarak, diger antioksidanlar ile etkilesime girerek, ve süperoksit anyonları, lipid peroksil

41

radikalleri ve hidroksil radikalleri gibi serbest radikalleri yakalayarak göstermektedirler [50-51].

Yaptığımız total flavonoid yöntemi sonuçları DPPH yöntemi sonuçlarını doğrulamaktadır. Metanol ekstresinin en yüksek değerde flavonoid içerdiği belirlendi ve gram ekstrede bulunan eşdeğer katakol miktarı 21.7 mg olarak belirlendi. Etanol ekstresinde 18.7 mgCAT/gr , petrol eterinde ise 9.7 mgCAT/gr olarak belirlendi. Sonuç olarak petrol eteri ekstresi flavonoid açısından diğer ekstrelere göre daha fakirdir.

Kalamouni ve arkadaşlarının (2009) yaptığı bir çalışmada Calamintha

grandiflora türünün uçucu yağlarını disk difüzyon metodu ile denemişler en iyi zon

çapını Bacillus subtilis ve Bacillus cereus üzerinde tespit etmişlerdir. Bu sonuçlar bizim çalışmamız ile kıyaslandığında kullandığımız test mikroorganizmalarından B.

cereus üzerinde yaklaşık aynı değerlerde zon çapı verdiği görüldü [52].

Dülger ve ark. (1999), çeşitli bitki yağlarının ve ekstrelerinin antimikrobiyal etkilerinin farklı olduğunu göstermektedir. Bitkinin sahip olduğu kimyasal kompozisyonundan, kullanılan mikroorganizma türünden, bitki ekstraksiyonu yapılıyorsa ekstraksiyonda kullanılan maddeden ve yöntemdeki farklılıklardan kaynaklanabileceği belirtmişlerdir [53] Mikroorganizmaların çeşitli kemoterapotik maddelere karşı duyarlılıklarının suştan suşa bile farklılık gösterdiği uzun zamandan beri bilinmektedir [54].

Aşkun ve ark. (2009) yaptıkları çalışmada Lamiaceae familyasına dahil olan

Origanum munitiflorum (sütçüler kekiği) ve Tymbra spicata L. var. spicata

(Karakekik) bitki türleri ile yapılan antimikobakteriyal aktivite çalışmalarında elde edilen yüksek aktivite sonuçlarını bitkilerin içerisinde bulunan rosmarinik asitin zengin olmasına bağlamışlardır [55]. Bitkimizde görülen yüksek antioksidan ve antimikrobiyal aktivitede içeriğinde bulunan rosmarinik asitle ilişkilendirilebilir.

42

Çalışmamız sonucunda farklı çözgenlerle yapılan ekstrelerde farklı sonuçlara rastladık. Bitkimiz üzerinde metanol, etanol ve petrol eteri ekstreleri ile ilgili biyolojik aktivite ve antioksidan aktivite çalışmalarına rastlanmadığından çalışmamızın literatüre katkıda bulunacaktır. HPLC sonuçları ile içeriğindeki fenolik maddeler tespit edildi. Bitkinin metanol ve etanol ekstrelerinde antioksidan aktivite yüksek değerler vermiştir. Bu yüzden bitkimizin antioksidan aktivite açısından zengin olduğu belirlendi. Petrol eteri ekstresinde de antimikrobiyal etki diğer ekstrelere göre daha yüksek bulundu.

43

5.EKLER

Şekil A.1 HPLC Standart kromatogramı

Standart kromatogram

Standartlar: 1; Gallic acid, 2; catechin, 3; chlorogenic acid, 4; caffeic acid, 5; epicatechin, 6; syringic acid, 7; p-coumaric acid, 8; ferulic acid, 9; rutin, 10; hesperidin, 11; apigenin-7-glucoside, 12; rosmarinic acid, 13; quercetin, 14; naringenin, 15; luteolin, 16; apigenin, 17; acecetin

44

45

46

47

5. KAYNAKLAR

[1] Başer, K. H. C., ‘‘Essential Oils of Anatolian Labiateae: A. Profile’’, Acta

Horticulturae (1993) 333: 217-237.

[2] Kocabaş, Y. Z. and Karaman, S., ‘‘Essential oils of Lamiaceae family from South East Mediterranean Region (Turkey), Pakistan’’, J. Biol. Sci., (2001) 4, 1221-1223.

[3] Davis, P.H., Mill, R.R., Tan, K., Flora Of Turkey and The East Aegen Island, Edinburg, (1988) 10: 29-58.

[4] Dirmenci, T., “Türkiye’ de Yetişen Nepeta L. (Lamiaceae) Türleri Üzerinde Taksonomik Araştırmalar”, Doktora Tezi, Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Balıkesir, (2003).

[5] Werker, E., Ravid, U., Putievsky, E., ‘‘Structure of Glandular Hairs and Identification of the Main Components of Their Secreted Material in Some Species of the Labiateae’’, Isr. J. Bot., (1985) 34(1):31-45.

[6] Karadoğan, T., ‘‘Göller Yöresinde Lamiaceae familyasına dahil bitki türlerinin tespiti ve aromatik değerlerinin belirlenmesi’’, Tübitak Proje NO: Togtag- 2599 , Isparta, (2003), 1-25.

[7] Alan, S., Ocak, A., ‘‘Taxonomical and morphological studies on the genus

Calamintha Miller (Lamiaceae) in Turkey’’, Biological Diversity and Conservation,

(2009) 125-143.

[8] Sarer, E., Pancali, S.S., ‘‘Composition of the essential oil from Calamintha

nepeta (L.) Savi ssp. glandulosa (Req.) P. W. Ball.’’, Flavour and Fragrance Journal, (1998). 13, 31-32.

48

[9] Kitic, D., Zlatkovic, B., ;Palic, R., Jovanovic, T., Rist, M., ‘‘Fatty acid of some plants of the genus Calamintha’’, Chemistry of natural compounds, (2009) 45(2), 231-233.

[10] Garbari,F., Jarvis, C. E.&Pagni, A.M : ‘‘Typification of Melissa calamintha L., M. nepeta L., and Thymus glandulosus Req. (Lamiaceae), with Some Systematic Observations – Taxon’’ (1991) 40: 499-504.

[11] Davis, P., H.,(ed), “Flora Of Turkey And East Aegean Islands”, Vol. 7, Edinb. Un. Press., Edinburgh, (2000).

[12] Panizzi L., Flamini G., Cioni PL, Morelli I., ‘‘Composition and antimicrobial properties of essential oils of four Mediterranean Lamiaceae.’’, J. Ethnopharmacol, (1993) 39(3):167-170.

[13] Souleles, C., Argyriadou, N., Philianos, S., ‘‘Constituents of the essential oil of

Calamintha nepeta’’, Journal of Natural Products, (1987) 50(3): 510-511.

[14] Kitic, D., Palic, R., Stojanovic, G., Ristic, M., ve Jovanovic, T., ‘‘Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential oil of Calamintha nepeta (L.) Savi subsp. glandulosa (Req.) P. W. Ball from Montenegro’’ J. Essent. Oil Res., (2002) 14, 150.

[15] Flamini, G., Cioni, PL., Puleio, R., Morelli, I., Panizzi, L., ‘‘Antimicrobial activity of the essential oil of Calamintha nepeta and its constituent pulegone against bacteria and fungi’’, Phytotherapy research, (1999) 13(4):349-351.

[16] Adams, M., Berset, C., Kessler, M., Hamburger, M., ‘‘Medicinal Herbs for the Treatment of Rheumatic Disorders a Survey of European Herbals from the 16th, 17th Century’’, Journal of Ethnopharmacology,(2008)121(3):343-59.

[17] Peter, D., Marin et all, ‘‘Acacetin glycosides as taxonomic markers in

49

[18] Alan, S., Kürkçüoğlu, M., Başer, C., ‘‘Composition of Essential Oils of

Calamintha nepeta (L.) Savi Subsp. nepeta and Calamintha nepeta (L.) Savi Subsp. glandulosa (Req.) P.W. Ball’’, Asian Journal of Chemistry, Vol. 22 , (2010).

[19] Kokkalou, E., Stefanou, E.,‘‘The volatile oil of Calamintha nepeta (L.) Savi subsp. glandulosa (Req.). Ball endemic to Greece’’, Flav. Fragr. J., (1990) 5, 23–26.

[20] Baldovini, N., Ristorcelli D., Tomi, F., Casanova J., ‘‘Infraspecific variability of the essential oil of Calamintha nepeta from Corsica (France)’’ Flav. Fragr. J. (2000) 15, 50–54.

[21] Bown D., The Herb Society of America Encyclopedia Of Herbs & Their Uses, Dorling Kindersley, New York, (1995) 97, 252.

[22] Baytop, T., Türkiye’de Bitkilerle Tedavi, Đstanbul Üniversitesi Yay. No. 3255, Ecz. Fak. Yay. No. 40, Đstanbul, (1999) 304, 371.

[23] Baytop, T., Türkçe Bitki Adları Sözlüğü, Türk Dil Kurumu Yay., No: 578, Ankara, (1994).

[24] Sklection du Reader's Digest, ‘‘Secrets et vertus des plantes medicinales," Paris, Bmelles, Montfi, Zurich (1977) p. 91.

[25] H.L. De Pooter et al., Pbytorbnistrry, 25, 69 1 (1986).

[26] Leonti, M., Casu, L., Sanna, F., Bonsignore, L., ‘‘A comparison of medicinal plant use in Sardinia and Sicily—De Materia Medica revisited’’, Journal of

Ethnopharmacology, (2008) 4(1):24.

[27] Guarreraa, P.M., Forti, G., Marignoli, S., ‘‘Ethnobotanical and ethnomedicinal uses of plants in the district of Acquapendente (Latium, Central Italy)’’, Journal of

50

[28] Guarrera, M.P., ‘‘Food medicine and minor nourishment in the folk traditions of Central Italy’’, Fitoterapia, (2003) 74: 515-544.

[29] Mimica-Dukic, N., Couladis, M., Tzakou, O., Jancic R., Slavkovska, V., ‘‘Essential Oils of Calamintha sylvstica Bromf.and Calamintha vardarensis Silic.’’

J. Essent. Oil Res., (2004) 16, 219–222.

[30] Kaynak, G. Daşkın R. Yılmaz, Ö., Bursa Bitkileri, Uludağ Üniversitesi Yayınları, Bursa, (2007).

[31] Souleles, C., Argyriadou, N., Philianos.S., ‘‘Constituents of the essential oil

Calamintha nepeta’’, J. Nat. Prod., (1987) 50 (3), pp 510–511.

[32]TÜBĐVES,http://wwweski.tubitak.gov.tr/tubives/index.php?com=18000&id=Cal amintha%20nepeta

[33] Rahman, A., Kang, S. C., “In vitro control of food-borne and food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb”, Food

Chemistry, (2009) 116, 670–675.

[34] Çavdar, C., Sifil, A., Çamsarı, T., ‘‘Reaktif oksijen partikülleri ve antioksidan savunma’’, Türk nefroloji Diyaliz ve Transplantasyon dergisi, (1997) 3-4: 9295

[35] Akdeniz, F., Gökçe, G., Güneş, F., Akgöl, S., Yucayurt, G., Rhodondendron ponticum ve Laurocerasus officinalis Bitkileriin Çeşitli Kısımlarından Elde Edilen Süperkritik ve Akışkan EkstratlarınınFenolik Bileşikler Açısından Analiz ve Antioksidan Aktivitelerinin Tayini( Tübitak Proje No: 106T296).

[36] Singh, R.P., Sharad, S., Kapur, S., ‘‘Free radicals and Oxidative stress in Neurodegenerative Diseases: Relevance of dietary Antioksidants’’, Journal, Đndian

51

[37] National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, IV. Ed., Approved Standard M7-A4, Wayne, P.A. (1997).

[38] National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Reference method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Approved Standard M27-A, Wayne, P.A. (1997).

[39] Milardovic, S., Ivekovic, D., Grabaric, B.S., “A novel amperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical”, Bioelectrochemistry, (2006) 68, 175–180.

[40] Tunalıer, Z., Öztürk, N., Koşar M., Başer, K.H.C., Duman, H.,ve Kırımer, N., “Bazı Sideritis Türlerinin Antioksidan Etki ve Fenolik Bileşikler Yönünden Đncelenmesi’’, 14. Bitkisel Đlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs, Eskişehir, (2002).

[41] Chang, C., Yang, M., Wen, H. and Chern, J.,“Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods”, Journal of

Food and Drug Analysis, (2002) 10(3), 178-182.

[42] Cuendet, M., Hostettmann, K., Potterat, O,H., ‘‘Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei’’ Helvetica Chimica Acta, (1997) 80, 1144-1152.

[43] Shimada, K. K., Fujikawa, K. Y., Nakamura, T., ‘‘Antioxidative properties of xanthan on autoxidation of soybean oil in cyclodextrin’’, J. Agric. Food Chem, (1992) 40, 945-948.

[44] Fukumoto, L. R., Mazza, G., ‘‘ Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds’’, J. Agric. Food Chem, (2000) 48, 3597-3604.

52

[45] Soares, J. R., Dins, T. C. P., Cunha, A. P. & Almeida, L. M., ‘‘ Antioxidant activity of some extracts of Thymus zygis’’, Free Radical Research, (1997) 26, 469– 478.

[46] Hatano, T., Edamatsu, R., Mori, A., Fujita, Y., Yasuhara, E., ‘‘Effect of interaction of tannins with co-existing substances. VI. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical and on DPPH radical’’, Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, (1989) 37, 2016–2021.

[47] Duh, P.D., Tu, Y.Y.,Yen, G.C., ‘‘Antioxidant activity of water extract of Harng Jyur (Chrysanthemum morifolium Ramat)’’, Lebnesmittel-Wissenschaft und

Technologie, (1999) 32, 269–277.

[48] Disilvestro, R.A., Flavonoids as Antioxidants. In: Handbook of Nutraceuticals and Functional Foods, Edit.: R.E.C. Wildman, CRC Press, ISBN: 0 8493 8734 5, USA, (2001), p:127-138.

[49] Shi, H., Noguchi, N., Niki, E., Intoducing Natural Antioxidants. In Antioxidants in food. Edit.: J Pokorny, N Yanishlieva and M Gordon, CRC Press, ISBN 1 85573 463, USA, (2001).

[50] El Kalamouni, C., Raynaud, C., Talou, T., ‘‘Screening of antioxidant and antimicrobial activities of Midi-Pyrenées aromatic plants’’, Cheminė Technologija, (2009). Nr. 3 (52).

[51] Dülger, B., Ceylan, M., Alıtsaous, M., Uğurlu, E., ‘‘Artemisia absinthium L. (Pelin)’un Antimikrobial Aktivitesi’’, Tr. J. Biology, (1999) 23: 377-384.

[52] Gürgen, A.R., ‘‘Türkiye’nin Önemli Eterik Yağları Üzerine Araştırmalar’’,

53

[53] Askun, T, Tumen, G., Satil, F., Ates M., “In vitro activity of methanol extracts of plants used as spices against Mycobacterium tuberculosis and other bacteria”,