Günümüzde mevcut tarım alanlarının sınırlarının zorlanmış olması ve tarımsal arazilerin miktarının arttırılmasının neredeyse imkansızlaşması, bilim çevrelerini harekete geçirmiş ve insanlığı birim alandan daha fazla ürün elde etme yoluna götürmüştür. Tarıma elverişli toprakların azalması, kullanılabilir su kaynaklarının çevre kirliliği ile özelliğini yitirmesi, artan Dünya ve ülke nüfusu ile birlikte değerlendirildiğinde, sürdürülebilir nitelikte, sağlıklı, güvenli ve yeterli gıda üretimiyle gıda güvenliği kaliteli bir yaşam ortamı oluşturmak önümüzdeki yıllarda kritik önem arz edecektir. Dünya’da son 30 yılda oluşan bilimsel ve teknolojik gelişmeler, özellikle verimlilikte önemli artışlara neden olmuştur. Türkiye’ de toplam bitkisel üretim yılda 90 ile 100 milyon ton seviyelerinde gerçekleşmektedir. Artık olağan dışı faktörler haricinde bu seviyelerin değişmesi beklenmemektedir.
Anadolu coğrafyası üzüm yetiştiriciliği bakımından Dünya için büyük öneme sahiptir. Yer kürenin bağcılık için en elverişli iklim kuşağı üzerinde bulunan Türkiye, asmanın gen merkezi dahilinde olmasının yanı sıra, son derece eski ve köklü bir bağcılık kültürüne sahiptir. Bağcılığın esas ürünü olan üzüm oldukça geniş bir kullanım alanına sahiptir. Türkiye’deki toplam meyve üretiminin büyük bir kısmını oluşturan üzüm kurutmalık ve sofralık olarak değerlendirilmekte, bir kısmının da şarap pekmez, sucuk, pestil ve sirke gibi ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır. Türkiye bağcılığı içe dönük bir yapıya sahiptir. Gerçekleştirilen üretimin büyük bölümü yurt içinde tüketilmekte, ancak küçük bir kısmı ihracata konu olmaktadır. İhracata konu olan kısmın büyük bir bölümü kuru üzüme aittir. Türkiye kuru üzüm üretiminde ve ihracatında Dünya’da ilk sırayı almaktadır.
Ülkemizde çok yıllık bahçe bitkileri tarımına ayrılan alanların önemli bir kısmı bağ alanlarıdır. Türkiye’de Doğu Anadolu’nun yüksek kesimleri ile Doğu Karadeniz sahil şeridi dışında kalan tüm bölgelerinde bağcılık yapılabilmektedir. Ülkemizde hem bağ üretim alanı, hem de üretim miktarı yönünden Ege Bölgesi birinci sırada gelmektedir. Bağ alanı ve üretim açısından ikinci sırada gelen Akdeniz Bölgesi’nin, sahil kuşağı erkenci, yayla kesimleri ise orta ya da geç mevsimde olgunlaşan üzüm çeşitlerinin yetiştiriciliği için elverişli koşullara sahiptir. Yüksek adaptasyon kabiliyetine sahip bir bitki olan asmanın özellikle diğer tarım ürünlerinin yetiştiriciliğine uygun olmayan iklim ve toprak koşullarına sahip alanların değerlendirilmesine olanak sağlaması bağcılığın önemini arttırmaktadır. Bağcılığın yılın hemen hemen her ayında yoğun iş gücü gerektiren bir faaliyet olması ve ülkemizde önemli bir konu olan istihdama bir ölçüde katkıda bulunması açısından da ayrı bir öneme sahiptir.
Dünya’da olduğu gibi Türkiye’de de son 50 yılda bağ alanlarındaki değişim incelendiğinde bağ alanlarında önemli bir azalma olduğu görülmektedir. Dünya bağ alanlarındaki azalışa rağmen üretimdeki artışı, yeni bağcılık sistemine, biyoteknoloji ve verimdeki artışa bağlanmaktadır. Türkiye’de bu artışın yeterli düzeyde olmamasının en önemli sebeplerinden biri hastalık ve zararlıların Türkiye’de verdiği zararlar gösterilebilir. Dünya’da oldukça geniş bir alanda kültürü yapılan asma, pek çok patojene karşı hassastır. Bağlarda, Taç Gali hastalığı tüm Dünya’da ve ülkemizde bağcılığı tehdit etmektedir. Söz konusu hastalıklar ile mücadelede erken uyarı, entegre ve biyolojik mücadele sistemleri yaygın ve etkin hale getirilemediği için veya yetersiz mücadeleden
dolayı, özellikle iklim koşullarının hastalık gelişmesi için uygun, ancak kontrolü için elverişsiz olduğu hallerde önemli ürün ve gelişme kayıpları meydana gelmektedir
Bağlarda meydana gelen hastalıklardan en önemlilerinden biri Taç Gali hastalığıdır. Taç Gali hastalığı, Dünya çapında üzüm yetiştiriciliği yapılan bölgelerin hemen hemen tamamında karşılaşılan, ekonomik açıdan en yıkıcı hastalıklardan biridir. Bağlarda Taç Gali hastalığına neden olan bakteriyel hastalık etmeni Rhizobium vitis’tir. Hastalık, asmanın üst aksamında tümörler ve asma köklerinde nekrotik dokular ile kendini gösterir. Rhizobium vitis, asmada odun boruları ile üst aksamlara taşınmakta ve çeşitli faktörler ile yaralanmış bitki üst aksamındaki hasarlı dokularda tümör oluşturmaktadır. Taç Gali hastalık etmenlerine karşı etkili bir mücadele yönteminin olmamasından dolayı, iklim koşullarının hastalık gelişimi için uygun olduğu bölgelerde, Rhizobium vitis önemli verim ve gelişme kayıplarına neden olmaktadır. Taç Gali hastalığı halen yürürlükte olan, İç Karantinaya Tabi Bitki Hastalık ve Zararlıları Hakkında Tebliğine göre ülkemizde iç karantinaya tabi hastalıklardan biridir. Rhizobium vitis’in asmalarda da sistemik olarak zarar yapması ve hastalıkla bulaşık vejetatif çoğaltma materyali kullanımı ile hızlı olarak yayılabilmesi, asma gibi ticari olarak tümüyle aşı yoluyla çoğalan bitkilerde bu patojenin yol açtığı verim ve kalite kayıplarının boyutunu aynı hızla artırmaktadır. Bu durum bağcılığın önemli bir kolu olan fidancılık için önemli bir tehlike arz etmektedir. Çünkü hastalık etmeni belirti vermeden üretim materyalleri vasıtası ile geniş alanlara yayılabilmekte ve erken dönemde fidanlıklarda oluşabilecek urlar fidan ölümlerine sebep olabilmektedir. Taç Gali ile enfekteli çoğaltma materyali ile tesis edilecek bir bağ ileri dönemlerde yok olma tehlikesiyle karşı karşıya kalabilmektedir. Asma ölümlerinden veya tesis edilmiş bir bağın bu nedenle elden çıkmasından dolayı oluşacak maddi kayıp göz önüne alındığında hastalıktan ari materyal kullanımının ne kadar büyük bir önem arz ettiği daha iyi anlaşılabilir. Ancak Taç Gali hastalığından korunmada sadece temiz üretim materyali kullanımının yeterli olmadığı da aşikardır. Çünkü hastalık etmeni Rhizobium vitis, hastalıklı asma artıklarında ve hatta diğer bitki artıklarında dahi canlılığını uzun yıllar sürdürebilmektedir.
Bakteriyel patojenlerin tanı ve tespitinde geçmişten günümüze kadar kullanılagelmiş pek çok farklı yöntem bulunmaktadır. Bu yöntemlerden başlıcaları hastalıklı bitki materyallerinden besi ortamlarına izolasyon, fidelerde belirti izleme yöntemi, test bitkilerine inokülasyon yöntemi, bakteriyofaj yöntemi, serolojik yöntemler, biyokimyasal yöntemler, protein elektroforezi, mikroorganizmaların yağ asidi kompozisyonunun belirlenmesi, mikroskopi ve genetik farklılıkların esas alındığı modern biyoteknolojik yöntemlerinden olan nükleik asit hibridizasyonu, AFLP, RFLP, sekanslama, PFGE, klasik PCR ve Real-Time PCR yöntemleri olarak sıralanabilir. Günümüzde nükleik asit temelli yöntemler diğer yöntemlerle göre oldukça hızlı ve güvenilir olmasından ötürü daha fazla tercih edilmektedir. PCR, patojenlerin tanı ve tespitinde yeni bir çığır açmış, hedef DNA parçacığını çoğaltarak, bir patojenin varlığı yokluğu çok daha kısa sürelerde tespit edilebilir hale gelmiştir. PCR’da sıcaklık döngülerini oluşturmak için kullanılan termal döngü cihazlarının hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, Real-Time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-Time PCR’da oluşan amplikonların miktarı reaksiyon esnasında eş zamanlı olarak takip edilebilmektedir. Bu sayede artık gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek ölçmek ve PCR esnasında eş zamanlı olarak reaksiyonun gidişine müdahalede bulunmak mümkün hale gelmiştir. Real-Time PCR sisteminde,
amplikonların agaroz jel elektroforezi ile ayrılması, DNA fragmentlerinin ultraviyole ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-Time PCR, tanı ve tespitlerin hızlı, güvenilir ve hassas şekilde gerçekleştirilebilmesi, direkt bitki dokularından tanı ve tespitin gerçekleştirilmesine olanak vermesi ile öne çıkmaktadır. Real-Time PCR analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalar veya belirli bir diziye spesifik problar kullanılmaktadır. Günümüzde kullanılan en gelişmiş prob sistemlerinden biri spesifik bağlanmalar için en uygun prob konformasyonunu sağlayan ve probun spesifik diziye afinitesini maksimize eden LNA prob sistemdir. LNA problara ait diziler, Real-Time PCR ile yapılan diğer çalışmalarda kullanılan probların dizilerinden uzunluk olarak daha kısa tasarlanabildiğinden prob dizisinin kendi içinde bağlanması olasılığı ortadan kalkmakta ve reaksiyonun daha kısa sürede sonuçlanması mümkün olmaktadır.
Bu çalışmada, asmada hastalık oluşturan bakteriyel patojenlerden Rhizobium vitis ele alınmış, patojenin hızlı tanı ve tespiti için etkili, hassas ve kesin sonuç elde edilebilen moleküler bazlı bir yöntem geliştirilmiştir. Real-Time PCR yöntemin kolaylığı, tanı ve tespitlerin hızlı, güvenilir ve hassas şekilde gerçekleştirilebilmesi, direkt bitki dokularından tespit yapılabilmesi, bitki patojeni bakterilerin tanı ve tespitlerini gerçekleştirmek amacıyla son yıllarda yöntemin kullanımının yaygınlaşmasında önemli rol oynamıştır. Bu çalışma ile Real-Time PCR yönteminin önemi ve hassaslığı bir kez daha ortaya konulmuştur.
Patojenik Rhizobium vitis strainlerinde bulunan, oktopin sentaz, nopalin sentaz, vitopin sentaz, virD2 ve iaaM gen bölgelerine ait diziler kullanılarak primer setleri ve bu setlere uygun problar tasarlanmıştır. Tasarlanan primer setleri ve problar kullanılarak oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainleri Real-Time PCR yöntemi ile tanılanmıştır. Türkiye’den izole edilmiş Rhizobium vitis strainlerinin tamamının oktopin katabolize eden Rhizobium vitis strainleri olduğu saptanmıştır. Vitopin katabolize eden Rhizobium vitis straini temin edilemediğinden vitopin katabolize eden strainlerin tanı ve tespitinde kullanılmak üzere tasarlanan primer setleri ve problar ile tespit gerçekleştirilememiştir. Tanı ve tespitlerde uygulanan PCR protokolleri optimize edilerek analizin yaklaşık 20 ila 25 dakika içinde sonuçlanabilir niteliğe kavuşması sağlanmıştır. Termal erime eğrileri ile primer setleri ve problar ile gerçekleştirilen amplifikasyonların tek bir diziye spesifik olduğu gösterilmiştir. Geliştirilen primer setleri ve problar farklı bakteri türleri ve farklı Rhizobium türlerine karşı test edilerek oluşturdukları reaksiyonların sadece Rhizobium vitis türlerinin oktopin ve nopalin katabolize eden strainlere has olduğu belirlenmiştir. Tasarlanan primer ve probların saf bakteri DNA’sından ve direkt bakteri hücresinden hassasiyet limitleri tespit edilmiş, 1 bakteri hücresinin dahi tespit edilebildiği gösterilmiştir. Real-Time Bio-PCR yöntemi ile sadece canlı bakterilerin yöntem ile tek başına tespit edilebildiği saptanmıştır.
Bu çalışmada geliştirilen primer setleri ve problar ile Real-Time PCR yöntemi, Rhizobium vitis’in kesin ve güvenilir tanı çalışmalarına önemli katkı sağlanmıştır. Tanı ve tespitin Real-Time PCR sistemi ile oluşturulmuş olması hastalığa dair tanı ve tespitlerin arazide gerçekleştirilmesine olanak vermekte ve sistemin ziraat gibi uygulamalı bir bilim dalındaki kullanılabilirliğini ve çok yönlülüğünü büyük ölçüde arttırmaktadır
Geliştirilen yöntemin yaygınlaştırılması sonucunda kısa sürede Rhizobium vitis ile bulaşık üretim materyallerinin tespiti mümkün olabilecek, fidan üretiminde ve sonuçta bitkisel üretimde temiz üretim materyali kullanımı sağlanarak Taç Gali hastalık etmeninin oluşturacağı kayıpların önüne geçilmesine büyük katkı sağlanacaktır. Rhizobium vitis karantinaya tabi bir hastalık etmeni olduğu için yurtdışından gelen üretim materyallerinin kısa ve etkili olan LNA prob kullanılarak Real-Time PCR yöntemiyle kısa bir sürede bitkilerin taranması önem arz etmektedir. Bu sayede ülkemizde bulunmadığı belirlenen nopalin ve vitopin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinin, ülkemize üretim materyali ile girişi önlenebilecektir. Rhizobium vitis strainlerinin hastalıklı dokularından alınan örneklerden tespitinin kolay aynı zamanda pratik bir şekilde gerçekleştirilebilmesi sağlanmış olması hastalığın tanı ve tespiti kadar epidemiyolojisinin saptanmasında da önem arz etmektedir.
Taç Gali, asmalarda görülen en tehlikeli hastalıklardan biridir ve üretimi büyük ölçüde sınırlamaktadır. Bu çalışmada, Rhizobium vitis’in hızlı ve güvenilir tanısını gerçekleştirebilmek için primer ve prob geliştirilmiş ve Taç Gali hastalık etmenini hastalıklı dokulardan ve baz materyallerinden kesin ve güvenilir tespiti sağlanmıştır. Bu çalışma ayrıca kantitatif olarak asma baz materyallerinin Rhizobium vitis’in oktopin ve nopalin strainlerinin belirlenmesi ile ilgili ilk çalışmadır. Bu çalışmada uygulanan kantitatif Real-Time PCR işlemi ile oluşturulan regresyon eğrileri (Şekil 4.16, Şekil 4.17) sayesinde oktopin ve nopalin strainleri ile asma baz materyallerinin bulaşıklılık oranlarını ortaya çıkarılabilme olanağı da sağlanmıştır. Bu sayede Taç Gali’nin oluşturacağı zarar en aza indirgenebilecek ve bu konuda daha genişletilmiş araştırmaların ortaya çıkmasına katkı sağlanabilecektir.