O preparo de amostra empregando a DLLME foi realizado empregando 2 mL de meio de cultura liquido Czapek acrescido de 2 mL de solução tampão borato de sódio 100 mmol L-1 pH 10. Os parâmetros otimizados foram tipo e volume de solvente extrator e dispersor e tempo de agitação (DLLME assistida).
3.2.3.1. Otimização do tipo e volume dos solventes dispersor e extrator
Na otimização do tipo de solvente dispersor foram avaliados os seguintes solventes: metanol, etanol, acetonitrila, isopropanol e acetona. Após definir o melhor solvente, seu volume foi avaliado entre 300 - 700 µL. Na otimização do solvente extrator, os seguintes solventes foram avaliados: clorofórmio, diclorometano, tetracloreto de carbono e dicloroetano. Após definir o melhor solvente, seu volume foi variado entre 70 a 400 µL.
3.2.3.2. Otimização do tempo de agitação das amostras (DLLME Assistida)
Em DLLME o equilíbrio de extração é atingido rapidamente devido à enorme superfície de contato proporcionada pelo ponto nuvem, formado ao injetar a mistura de solventes extrator e dispersor, rapidamente em uma amostra aquosa. Essa superfície de contato geralmente acarreta altos valores de recuperação dos analitos. Porém, a agitação das amostras após formação do ponto nuvem e antes da centrifugação pode aumentar ainda mais a eficiência de extração e, portanto a recuperação (REZAEE et al., 2006; MENG et al., 2011; CALDAS; GONÇALVEZ; PRIMEL, 2011; ZGOTA-GRZESKOWIAK; GRZESKOWIAK, 2011; REZAEE; YAMINI; FARAJI, 2010; XIAO-HUAN et al., 2009). Para avaliar a influência desse parâmetro, foram avaliados os seguintes tempos de agitação das amostras: 0, 5, 10, 20 e 30 segundos após a formação do ponto nuvem.
3.3. ESTUDOS DE BIOTRANSFORMAÇÃO
3.3.1. Fungos
Os fungos utilizados nos experimentos de biotransformação foram Mucor
rouxii NRRL 1894 obtido como uma cortesia do Dr. C.W. Hesseltine (Northern
Utilization Research and Developmente Division, ARS, USDA, Peoria, IL, USA) e pertencente a coleção de culturas de fungos do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
Os fungos Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A,
Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beuveria bassiana ATCC 7159 foram
adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Os fungo endofítico Phomopsis sp (TD2) foi previamente isolado da planta
Tithonia diversifolia enquanto os fungos Chaetomiun globosun (VR10) e Glomerela cingulata (VA1) foram isolados da planta Viguiera robusta. Os fungos endofíticos e
os fungos do gênero Cunninghamella são mantidos em discos de meio BDA, com 0,5 cm de diâmetro, imersos em solução estéril de glicerol 80% e armazenados a temperatura de -20 ºC. Os fungos endofíticos estão estocados no Laboratório de Química de Micro-organismos−FCFRP/USP, Brasil.
3.3.2. Equipamentos
A esterilização dos instrumentos e meios de cultura foi realizada em uma autoclave vertical da marca Phoenix (Araraquara, SP, Brasil) modelo AV 75. A manipulação dos instrumentos, meios de cultura e fungos foi realizada em uma capela de fluxo laminar vertical modelo 310 da marca Pachane (Piracicaba, SP, Brasil). Os fungos foram incubados e permaneceram sob agitação em um shaker de bancada da marca Cientec (Piracicaba, SP, Brasil) modelo CT 712 RN.
3.3.3. Reagentes
3.3.3.1.Preparo do meio de cultura PDA
Para o preparo do meio de cultura PDA foi usado o reagente Potato Dextrose
Agar da Acumedia (Lansing, Michigan, EUA) na concentração de 39 g L-1. e, após a pesagem, completa-se com quantidade necessária de água ultra-pura para tantos quantos forem o número de placas de Petri a serem utilizadas nesta primeira etapa. São necessários 15 mL de meio para cada placa de Petri. Por fim, essa mistura é esterilizada em autoclave por cerca de 30 minutos para posterior distribuição do meio em cada placa.
3.3.3.2. Preparo do meio de cultura pré-fermentativo Malte
Para o meio pré-fermentativo Malte foram utilizados os reagentes triptona (5,0 g L-1), extrato de levedura (3,0 g L-1) e extrato de malte (10 g L-1) todos da Acumedia (Lansing, Michigan, EUA) e dextrose (10 g L-1) da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, EUA). Posteriormente é adicionado água ultrapura no volume desejado desde que as concentrações em massa permaneçam as mesmas. Tal mistura gera uma solução líquida de pH próximo de 7 que é corrigido para pH 6,2 utilizando-se ácido clorídrico 0,5 mol L-1. Em seguida, esse meio é também esterilizado em autoclave da mesma forma que para o meio PDA.
3.3.3.3. Preparo do meio de cultura Czapek Modificado
Para o preparo do meio de cultura líquido Czapek foram utilizados os reagentes sacarose (3%) da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, EUA); cloreto de potássio (0,05%), sulfato de magnésio heptaidratado (0,05%), fosfato de potássio (0,1%), sulfato de ferro heptaidratado (0,001%) todos da Merck (Darmstadt, Germany) e nitrato de sódio (0,2%) da JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Em seguida, adiciona-se água ultrapura no volume desejado desde que as concentrações em massa permaneçam as mesmas. A mistura gera uma solução liquida de pH próximo de 8 que deve ser corrigido para pH 5,0 utilizando-se HCl 1,0 mol L-1. Da mesma forma que para os outros meios de cultura, esta mistura é esterilizada em autoclave.
3.3.4. Método
Inicialmente os fungos filamentosos em estudo foram repicados, em duplicata, em placas de Petri contendo o meio de cultura PDA e incubados a 30º C. Em seguida, após o crescimento dos fungos sobre a placa, três discos de 0,5 cm do meio de cultura com os fungos foram retirados com o “transfer tube” e inoculados assepticamente em 10 mL de meio pré-fermentativo de malte e colocados sob agitação de 120 rpm a uma temperatura de 30º C por 10 dias para o crescimento dos fungos. Em seguida, a massa micelial formada foi transferida assepticamente para 100 mL de meio Czapek Modificado juntamente com a venlafaxina (3 mg). A
incubação (30° C, 120 rpm) foi realizada por 20 dias sendo que a cada 5 dias foi coletada uma alíquota de 4 mL do fluído da cultura assepticamente e armazenado a −20°C até o momento da análise (Figura 6). As alíquotas foram submetidas à extração e posteriormente analisadas. Paralelamente aos estudos de biotransformação foram realizados controles contendo: (i) somente o meio de cultura e o fármaco, (ii) somente o meio de cultura e o fungo sem o fármaco.
Alterações nas condições de biotransformação dos fungos foram realizadas para favorecer a biotransformação e/ou o excesso enantiomérico. O excesso enantiomérico (ee) foi avaliado de acordo com a seguinte equação: ee = (A–B/A+B) x 100; onde A é o enantiômero em maior concentração e B o enantiômero em menor concentração.
Figura 6- Esquema representativo do procedimento de biotransformação de fungos.