Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos do confrei no fígado e nos rins dos ratos foram usadas como base as alterações citadas na literatura por pesquisadores que estudaram os efeitos do confrei ou dos AP isoladamente, como pode ser verificado no quadro apresentado no apêndice A. Foram analisados aspectos indicativos de intoxicação aguda e crônica como reação inflamatória e suas seqüelas e alterações vasculares e circulatórias.
As alterações observadas foram semelhantes nos grupos controle e tratados com as duas formulações de confrei, variando apenas na quantidade ou intensidade dos itens avaliados. Os dados são descritos a seguir.
5.3.2.1 Grupos controle de 30 e 60 dias: análise histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos acúmulos de leucócitos, que na grande maioria dos casos eram de células mononucleares, basicamente linfócitos. Raramente foram observados alguns neutrófilos em meio ao foco inflamatório. Não foram encontrados eosinófilos, macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os focos inflamatórios (Figura 14) se localizaram nos espaços porta, em áreas intralobulares ou na região centrolobular, por vezes atingindo a parede da veia centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da localização portal, seguida pela intralobular e depois pela centrolobular. Aos 60 dias predominou a localização portal, seguida pela intralobular e depois pela centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios em espaço
porta foi praticamente a mesma nos 30 e 60 dias, porém, a inflamação nas outras localizações diminuiu sensivelmente.
A necrose de hepatócitos (Figura 15) isolados ocorreu em pequena proporção, sendo 5 focos aos 30 dias e 1 foco aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos em grandes espaços porta foi encontrada em 1 caso aos 30 dias e em 2 casos aos 60 dias.
A proliferação canalicular foi um achado pouco consistente uma vez que só foi observado em grandes espaços porta, como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e não foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 3 animais e aos 60 dias em 5 animais.
A fibrose foi observada em apenas um foco em um animal aos 30 dias, como delicada radiação que se estendia a partir de uma veia centrolobular. Aos 60 dias foi observado um discreto aumento das fibras colágenas em um espaço porta de 1 animal e em um foco intralobular de outro animal.
Entre as alterações vasculares foi observado congestão discreta em região centrolobular em várias áreas em 1 animal aos 30 dias e em 2 animais aos 60 dias. Não foram encontradas lesões endoteliais, áreas de hemorragia, espessamento ou obliteração da luz de veia em nenhum animal nos dois tempos experimentais. Um animal do grupo C60 exibia espessamento de parede em uma única artéria em um grande espaço porta.
Degeneração vacuolar representada por discreta quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os animais. Esta alteração era mais evidente nas zonas periféricas subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao acaso ou em áreas centro lobulares.
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de destaque.
5.3.2.2 Grupos controle de 30 e 60 dias: análise histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas de nota. Não foram encontrados focos de inflamação ou de fibrose, congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos experimentais.
5.3.2.3 Grupos tratados com confrei homeopático de 30 e 60 dias: análise histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos acúmulos de leucócitos, que eram de células mononucleares, basicamente linfócitos. Não foram observados no foco inflamatório neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os focos inflamatórios se localizaram principalmente nos espaços porta, e por vezes em áreas intralobulares ou na região centrolobular e na parede da veia centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da localização em espaço porta, com cerca de 50% dos focos, seguida pela localização intralobular e pela centrolobular. Aos 60 dias predominou a localização
portal, com cerca de 2 terços dos focos, seguida pela intralobular e depois pela centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios foi maior aos 30 dias que aos 60 dias, sendo que em espaço porta foi 3,7 vezes maior e nas outras localizações foi 6 vezes maior, evidenciando que a intensidade de inflamação diminuiu sensivelmente com o tempo.
A necrose de hepatócitos isolados ocorreu em pequena proporção, sendo 4 focos aos 30 dias e nenhum foco aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos (Figura 19) em grandes espaços porta foi encontrada em 3 casos aos 60 dias e em nenhum caso aos 30 dias.
A proliferação canalicular aqui também foi um achado pouco consistente uma vez que só foi observado em grandes espaços porta, como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e não foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 10 animais e aos 60 dias em 3 animais.
A fibrose aos 30 dias foi observada em apenas 3 animais, somando um total de 4 focos, como delicada radiação que se estendia a partir de 2 veias centrolobulares ou como delicada trama em dois pequenos focos intralobulares. Aos 60 dias não foi observado nenhum foco de fibrose nos animais.
Aos 30 dias, entre as alterações vasculares foi observada congestão discreta, na região centrolobular, somando um total de 5 áreas em dois animais. Também foram encontradas 8 áreas de hemorragia discreta, aparentemente associadas com pequenas lesões endoteliais focais. Não foi observada congestão, hemorragia ou lesão endotelial aos 60 dias, nem espessamento ou obliteração da luz de veia em nenhum animal nos dois tempos experimentais.
Degeneração vacuolar (Figura 17) representada por discreta quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os
animais. Esta alteração foi mais evidente nas zonas periféricas subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao acaso ou em áreas centro lobulares. Em cerca de metade dos animais a vacuolização foi de intensidade moderada na região periférica.
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de destaque.
5.3.2.4 Grupos tratados com confrei homeopático de 30 e 60 dias: análise histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas de nota. Não foram encontrados focos de inflamação ou de fibrose, congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos experimentais.
5.3.2.5 Grupos tratados com confrei fitoterápico de 30 e 60 dias: análise histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos acúmulos de leucócitos, que eram de células mononucleares, basicamente linfócitos. Assim como no tratamento homeopático, não foram observados no foco inflamatório neutrófilos, eosinófilos,
macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os focos inflamatórios se localizaram principalmente nos espaços porta e por vezes em áreas intralobulares ou na região centrolobular e na parede da veia centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da localização em espaço porta, com cerca de 50% dos focos, seguida pela localização intralobular e pela centrolobular. Aos 60 dias predominou a localização portal, com cerca de 75% dos focos, seguida pela intralobular e depois pela centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios foi maior aos 30 dias que aos 60 dias, sendo que em espaço porta foi 1,3 vezes maior, na região intralobular foi 2 vezes maior e na área centrolobular foi 4 vezes maior. A intensidade de inflamação diminuiu sensivelmente com o tempo, principalmente fora do espaço porta.
A necrose de hepatócitos isolados ocorreu em pequena proporção, sendo 5 focos aos 30 dias e 3 focos aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos em grandes espaços porta foi encontrada em 3 casos aos 30 dias e em 4 casos aos 60 dias.
A proliferação canalicular foi observada em grandes espaços porta, como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e não foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 9 focos e aos 60 dias em11 focos.
A fibrose (Figura 16 b) aos 30 dias foi observada em todos os animais, somando um total de 22 focos, sendo 1 em espaço porta, 16 em região centrolobular e 5 em áreas intralobulares. Os focos consistiam em fibrose delicada com radiação que se estendia a partir de veias centrolobulares ou de delicada trama focal envolvendo alguns hepatócitos em áreas intralobulares. Aos 60 dias foi observada fibrose em 2 terços dos animais, distribuídas de modo semelhante nas diversas localizações.
Aos 30 dias, entre as alterações vasculares foi observada congestão discreta (Figura 16 a), na região centrolobular, em
75% dos animais, somando um total de 25 áreas nos seis animais. Também foram encontradas 2 áreas de hemorragia intralobular discreta em dois ratos. Aos 60 dias foi encontrada congestão discreta em todos os ratos e um foco de hemorragia. O espessamento de parede de artéria (Figura 19) em grandes espaços porta foi observado em 13% dos animais aos 30 dias e em 50% dos animais aos 60 dias. Lesão endotelial ou veias com espessamento de parede ou obliteração da luz não ocorreu em nenhum animal nos dois tempos experimentais.
Degeneração vacuolar representada por discreta quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os animais. Esta alteração foi mais evidente nas zonas periféricas subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao acaso ou em áreas centro lobulares. Em um terço dos animais a vacuolização foi de intensidade moderada.
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de destaque.
5.3.2.6 Grupos tratados com confrei fitoterápico de 30 e 60 dias: análise histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas de nota (Figura 18). Não foram encontrados focos de inflamação ou de fibrose, congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos experimentais.
Figura 14 - Alterações inflamatórias no fígado. a) inflamação crônica ao redor de veia centrolobular. Grupo F, 60 dias, HE 200X b) região centrolobular mostrando inflamação destruindo parte da parede da veia e provocando um foco de hemorragia. Grupo F, 60 dias, HE 400X.
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Figura 15 - Alterações inflamatórias no fígado. a) focos de inflamação crônica na parede de veias centrolobulares se difundindo para áreas intralobulares, grupo F, 60 dias. HE 400X. b) foco em região intralobular ao redor de hepatócito necrosado, grupo F, 30 dias. HE 400X.
a
Figura 16 - Alterações microscópicas no fígado. a) congestão na região centrolobular, grupo C, 30 dias. HE 400X. b) região centrolobular, com congestão, focos de inflamação na parede de veia centrolobular e fibrose discreta se irradiando em direção aos hepatócitos, grupo F, 30 dias. Tricrômico de Mallory 400X.
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Figura 17 - Alterações microscópicas. a) Degeneração vacuolar em fígado na região periférica subcapsular, grupo H, 30 dias. HE 400X. b) Degeneração vacuolar na região centrolobular, grupo C, 30 dias. Tricrômico de Mallory 400X.
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Figura 18 - Alterações microscópicas. a) rim exibindo túbulos normais na região medular, grupo F, 30 dias. b) cortical renal exibindo glomérulos e túbulos contorcidos normais, grupo F, 60 dias. HE 400X.
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Figura 19 - Alterações em espaço porta. Artéria com espessamento de parede, proliferação de canalículos biliares, dilatação de vasos linfáticos e inflamação crônica, grupo H, 60 dias. a) HE 200X . b) Tricrômico de Mallory 200X.
b
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6 DISCUSSÃO
As enzimas, catalisadores orgânicos que são responsáveis pela maioria das reações químicas do corpo, são encontradas em todos os tecidos. Algumas são identificadas no plasma ou no soro e a mensuração de sua taxa sanguínea pode indicar um estado de normalidade ou de dano celular (Pincus et al., 1995).
A FA trata-se não de uma enzima, mas de uma família de enzimas, produzida em vários tecidos incluindo ossos, fígado, rins, intestino, pulmões, placenta, leito vascular, neutrófilos e linfócitos T ativados e é encontrada normalmente no sangue de pessoas sadias (Alves e Arruti, 2008; Motta, 1989).
Podem-se observar valores diminuídos da atividade da FA no hipotiroidismo do adulto ou no cretinismo e também no escorbuto. A taxa de FA pode aumentar em casos de lesões hepáticas como fibrose, cirrose, obstrução biliar (colelitíase), hepatocarcinoma e metástases (Motta, 1989). Também aumenta sempre que aumente a atividade de osteoblastos, em situações como na fase de consolidação óssea de fraturas, durante o período de crescimento em crianças e jovens e em situações que resultem em alterações na remodelação óssea em doenças como a osteomalácia, a Doença de Paget e o câncer ósseo primário ou secundário (mieloma múltiplo, sarcomas, metástases) (Gorina, 1984).
Valores aumentados de FA são observados em muitas outras doenças como raquitismo renal, insuficiência renal crônica, diabetes mellitus, septicemia, colite ulcerativa ou outras doenças intestinais inflamatórias, tireotoxicose, hiperparatiroidismo, má absorção intestinal de vitamina D, infartos do miocárdio, pulmonares e renais e algumas doenças autoimunes. Também é observado um aumento discreto, considerado fisiológico, na ingestão aumentada de gorduras e na gestação normal (Jorge, 2006).
Segundo Nobre et al. (2004), nos animais em que foi dosada a fosfatase alcalina houve um aumento marcante da mesma. Esta enzima apesar de não ser hepato-específica aumenta nos casos de danos hepáticos em decorrência de sua liberação na superfície sinusoidal dos hepatócitos, bem como na regurgitação das iso-enzimas biliares nos casos de colestase. A intoxicação por alcalóides pirrolidizínicos (AP) pode alterar a face sinusoidal dos hepatócitos e também provocar colestase.
Em nosso trabalho não foi observado aumento significante da atividade enzimática da FA relacionado ao tratamento com confrei, tanto na forma fitoterápica quanto na homeopática. Entretanto, foi observado um aumento da atividade no período de 60 dias em relação ao de 30 dias, em todos os grupos, inclusive nos grupos controle.
Julgando-se pela idade dos animais na época do sacrifício (4 e 5 meses de idade) pode se aventar uma influência discreta na atividade enzimática da FA devido aos animais estarem em fase de crescimento ósseo e do organismo como um todo. Também não se pode concluir que indica a presença de alterações hepáticas causadas especificamente pelo confrei, uma vez que ocorreu também no grupo controle. Esta variação deve refletir outras alterações teciduais às quais todos os animais estiveram sujeitos ao longo do experimento e que aumentaram com o tempo de exposição. Alguns autores relatam aumento de FA em situações de inflamação intestinal, como a retocolite ulcerativa e a Doença de Crohn (Jorge , 2006). No entanto, não foram avaliadas neste trabalho alterações inflamatórias no trato gastrointestinal, lesões consecutivas ao uso repetitivo de gavagem ou lesões associadas ao estresse da manipulação diária.
A atividade das aminotransferases tem sido usada como indicadora de danos hepatocelulares desde 1955. A ALT é encontrada no fígado e catalisa a transferência do grupo amino da alanina, permanecendo o ácido pirúvico (Pincus et al., 1995).
A atividade da ALT é significativamente elevada em uma variedade de alterações hepáticas incluindo infecções virais, cirrose, esteatose não alcoólica e toxicidade por drogas. Entretanto, também há relatos de casos em que a ALT não se encontra aumentada em alguns pacientes com doenças hepáticas histologicamente confirmadas como cirrose, esteatose não alcoólica ou hepatite C (Yang et al., 2009).
O aumento da atividade da ALT sérica também pode ser observado em condições não associadas a danos hepáticos como doenças musculares e doença celíaca e também pode aparecer em pessoas aparentemente saudáveis (Yang et al., 2009).
Na avaliação de toxicidade por drogas há alguns exemplos em que a elevação de ALT sérica em roedores ocorreu mesmo na ausência de danos histológicos ao fígado (Yang et al., 2009).
Em nosso trabalho observamos que houve diferença significante na atividade enzimática de ALT no período de 30 dias quando C60 foi menor que C30 e no período de 60 dias quando o grupo F60 foi maior que C60. O tratamento homeopático levou a aumento discreto não significante de 30 para 60 dias. Estes dados podem sugerir, em nosso modelo experimental, uma lesão hepática discreta e crescente dependente do tempo e do tipo de tratamento. Nessas condições o aumento da permeabilidade da membrana plasmática hepática permite o extravasamento da enzima do meio intracelular para o plasma sanguíneo. A enzima AST, que catalisa a transaminação de L- aspartato e alfa-cetoglutarato em oxalacetato e glutamato, é encontrada em quase todos os tecidos, logo, a atividade sérica da AST não é específica para nenhum tecido, porém o músculo e o fígado podem ser considerados suas maiores fontes (Silva et al., 2007).
A AST está elevada nas doenças que envolvem os tecidos que são ricos nesta enzima, sendo estes o coração, fígado, músculo esquelético, rins, cérebro, pâncreas, baço e pulmões. Observa- se diminuição da AST durante a gravidez e aumento durante o infarto do
miocárdio, hepatite aguda (viral ou tóxica), cirrose, congestão hepática e icterícia obstrutiva entre outras doenças. Apesar de a enzima AST apresentar grande atividade no infarto do miocárdio, existe outras enzimas que são indicadores suficientes e confiáveis de necrose miocárdica, tornando o uso da AST redundante (Pincus et al., 1995).
Oitenta por cento da AST dos hepatócitos está nas mitocôndrias. Teoricamente, no dano hepatocelular leve, quando a membrana plasmática do hepatócito está danificada, mais AST e ALT citoplasmático são liberados no soro. Com dano hepatocelular mais grave, os danos mitocondriais causam a liberação da AST mitocondrial, elevando a atividade catalítica da AST. Assim, a AST é usada para monitorar a terapia com drogas potencialmente hepatotóxicas; um resultado acima de três vezes o limite superior normal deverá sinalizar o término da terapia (Pincus et al., 1995).
Em nossos resultados não foi observada diferença estatisticamente significante entre o grupo controle e os grupos tratados aos 30 ou aos 60 dias. Em relação a cada tratamento, individualmente, foi observado que a atividade enzimática de AST no grupo controle diminuiu discretamente aos 60 dias e que aumentou discretamente nos grupos tratados. Porém, só houve diferença significante entre os grupos H30 e H60. Estes dados parecem não demonstrar toxicidade hepática associada ao uso do confrei fitoterápico em nosso modelo experimental. A pequena diferença observada com o tratamento homeopático pode estar relacionada à ação da medicação homeopática no fígado ou em algum outro tecido não identificado pela nossa metodologia. A literatura científica atual não sugere os mecanismos de ação do confrei homeopático o que dificulta nossa discussão sobre os achados.
A enzima GGT está presente na membrana celular e nas frações microssomais e pode estar envolvida no transporte de aminoácido através das membranas celulares e no metabolismo da glutationa. Os rins, o fígado e o pâncreas são ricos em GGT. O principal valor clínico da
medida de GGT está no estudo de doença hepatobiliar (Pincus et al., 1995).
A atividade desta enzima aumenta no soro de pacientes com lesões hepatobiliares, nas hepatites virais agudas e na hepatite alcoólica, assim como nas hepatites crônicas e na obstrução biliar. Esta enzima é particularmente interessante no reconhecimento das metástases hepáticas de uma neoplasia e constitui a enzima de maior sensibilidade como teste de triagem de distúrbio hepático (Gorina, 1984).
Bondan (2006), que estudou bovinos intoxicados por Senécio, observou que a atividade das enzimas AST e GGT no soro foi significativamente maior no grupo intoxicado por Senécio quando comparadas ao grupo controle.
Segundo Nobre et al. (2004), GGT é um bom marcador para doença subclínica nos equinos. A elevação dos níveis séricos de GGT tem um alto grau de especificidade para danos hepáticos. A GGT normalmente está limitada ao retículo endoplasmático liso, onde o