A comparação entre as médias do número de gânglios dos plexos miontérico e submucoso da parede intestinal revelou diferença
estatisticamente significante entre os grupos 1 e 3 (p = 0,0117), grupos 1 e 2 (p < 0,05) e grupos 2 e 3 (p = 0,0295). Observou-se subjetivamente na microscopia um aumento moderado no volume dos gânglios do grupo 1, nos dias 3º, 6º e 13º, que não foi verificado nos grupos 2 e 3.
Tabela 3: média e desvio padrão; contagem de gânglios do plexo nervoso intestinal de ratos.
Proteína S 100 3º dia 6º dia 13º dia Média Padrão Desvio
Grupo 1 10.80 10.90 11.60 11.1000 0.4359
Grupo 2 14.80 14.50 15.50 14.9333 0.5132
Gráfico 2: Comparação entre as médias dos gânglios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni
Constatou-se diferença estatisticamente significativa nas médias do número de neurônios encontrados dentro dos gânglios entre os grupos 1 e 3 (p < 0,05) e os grupos 2 e 3 (p < 0,05) , porém não significativa entre os grupos 1 e 2 (p = 0,1376)
Tabela 4: média e desvio padrão; número de neurônios nos gânglios do plexo nervoso intestinal.
Gráfico 3: Comparação entre as médias dos neurônios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni
NSE (enolase) 3º dia 6º dia 13º dia Média Padrão Desvio
Grupo 1 2,12 2,64 2,87 2,5433 0,3842
Grupo 2 2,45 2,96 3,18 2,8633 0,3745
Figura 27, 28, 29 – fotomicrografias de gânglios nervosos do plexo mioentérico – Proteína S-100 (seqüência de aumentos 100x, 200x, 400x) - grupo 3.
Figura 30, 31, 32 – fotomicrografias de gânglios nervosos do plexo mioentérico – Proteína S-100 (seqüência de aumentos 100x, 200x, 400x) - grupo 2.
S 100
NSE
Figuras 33 e 34 – fotomicrografias de gânglio (Proteína S 100) e neurônio (NSE) do plexo mioentérico - análise comparativa da mesma estrutura - grupo 2 (400x).
4.3 Determinação do Óxido Nítrico Tecidual:
Nas amostras de íleo, do 3º dia de vida, foi encontrada diferença estatisticamente significativa na concentração média de óxido nítrico entre os grupos 1 e 2 (p = 0.0023) e entre 1 e 3 ( 0,0040) mas não entre 2 e 3 (p = 0,6915). O grupo do pré-tratamento com L-Arginina registrou maior
quantidade tecidual de NO: grupo 1 = 7,3 ± 2,0 µMol e grupo 2 = 16,5 ± 4,9 µMol (p=0,0019).
Tabela 5 - estatística – concentração do NO (µMol) no íleo.
0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 grupo 1 grupo 2
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 7.30 16.48 17.85 p = O.0019
Desvio Padrão 2.02 4.91 6.10 p (1 e 2) = 0.0023 p (1 e 3) = 0.0040 p (2 e 3) = 0.6915
Gráfico 5 – comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Íleo.
A comparação do nível do NO em cólon nas amostras do 3º dia, entre os grupos 1 e 2, grupos 1 e 3, e grupos 2 e 3, não apresentou diferença estatisticamente significativa ( p = 0,3568).
Tabela 6 - estatística – concentração do NO (µMol) no cólon
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 10.7 15.6 15.9 p = 0.3568
Desvio Padrão 4.60 8.69 7.73 Grau de liberdade = 2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2 3 4 5 6 7 8 grupo 1 grupo 2
Gráfico 6 – comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Cólon.
Gráfico 8 - Média - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon.
4.3 Determinação de Malondialdeido:
Nas amostras intestinais dos roedores no 3º dia de vida foram observados entre os grupos 1 (H/R) e 3 (CTL) e entre os grupos 1 (H/R) e 2 (ARG) diferença estatisticamente significativa nas médias da concentração do MDA, respectivamente p = 0,0030 e p = 0,0213. Entre os grupos 2 (ARG) e 3 (CTL) com (p = 0,2771) a diferença das médias do MDA não foi estatisticamente significativa.
Tabela 7 - estatística – concentração intestinal do MDA (nMol/mg proteínas)
Gráfico 10: comparação da concentração de MDA entre grupos - Student-Newman-Keuls
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 8,91 6.01 4.73 p = O.0059
Desvio Padrão 1,90 1.81 0.93 p (1 e 2) = 0.0213 p (1 e 3) = 0.0030 p (2 e 3) = 0.2771
5. DISCUSSÃO
Apesar de diversos estudos experimentais ainda não é inteiramente compreendido o mecanismo de lesão tecidual na ECN, permanecendo a mais grave doença gastrintestinal do período neonatal com elevada mortalidade (45%) 1, 3, 6. A gravidade e o prognóstico na ECN estão também correlacionados com o comprometimento de outros órgãos devido a liberação de mediadores inflamatórios na corrente sangüínea 75. Vários fatores
agravantes e predisponentes já foram descritos, porém não se estabeleceu um tratamento padrão de sucesso para a ECN. Modelos têm sido propostos buscando reproduzir em animais as lesões intestinais características da ECN objetivando estudar os fatores desencadeantes, os mecanismos de agressão tecidual e avaliar possíveis substâncias protetoras. A isquemia intestinal desempenha um importante papel na fisiopatologia da ECN devido à sensibilidade da mucosa a hipóxia 2, 57. Durante a asfixia neonatal e hipóxia,
ocorre redistribuição da volemia com perfusão preferencial para órgãos mais imprescindíveis em detrimento da pele e sítios esplâncnicos que sofrem vasoconstrição e isquemia 20, 21, 22. A lesão da mucosa intestinal na H/R ocorre
pela redução do oxigênio indispensável à respiração celular dos tecidos, mas também por um complexo processo de agressão celular durante a
reoxigenação envolvendo aumento da permeabilidade vascular, produção de mediadores inflamatórios, ativação e adesão de polimorfonucleares, agregação plaquetaria, infiltração de células inflamatórias, produção de radicais livres, causando peroxidação lipidica e apoptose5, 14. Citocinas, radicais superóxidos, fator de ativação plaquetaria, fator de necrose tumoral e leucotrienos tem importante papel na ECN15, 16.
O tecido intestinal é excepcionalmente susceptível as manifestações de hipóxia seguidas de reoxigenação 13. Autores observaram alterações precoces na mucosa e no endotélio intestinal de animais expostos à hipóxia, outros relataram necrose isquêmica intestinal nestas condições4, 8, 59. Pesquisadores reproduziram as lesões da ECN utilizando alimentação artificial com formula láctea acompanhada de múltiplos eventos de hipóxia e hipotermia 2. Um modelo de H/R utilizando câmara de gás com atmosfera controlada foi proposto por autores turcoscom obtenção de elevados índices de lesões características de ECN em ratos 50, 51.
Substâncias diversas com potencial protetor dos tecidos metabolicamente ativos tem sido alvo de pesquisa. Lactobacilos acrescentados na dieta dos recém-nascidos diminuem os níveis de fosfolipase A2 intestinal e de endotoxinas plasmática, reduzindo o risco de
marcadores bioquímicos da H/R e tem alguns efeitos benéficos nas alterações histopatológicas dos intestinos de ratos induzidos a injuria 8. Entre nós, Meyer e cols comprovaram que a glicina reduz a peroxidação lipidica tecidual em ECN induzida por H/R em ratos 63. Sukhotnik e cols encontraram que a exposição dos ratos a L-arginina oral em modelo de H/R, não previne o intestino do dano isquêmico, mas acelera significativamente a reparação da mucosa intestinal lesada 49, 61, 65. Interleucina recombinante humana poderia reduzir as lesões intestinais de ratos 6, 64.
O NO participa em importantes processos biológicos e contribui para manter a integridade da mucosa intestinal protegendo os intestinos das agressões de mediadores inflamatórios 29, 37, 39. Atuando como vasodilatador arteriolar o NO contribuiria para manter a perfusão distal e periférica dos tecidos submetidos as condições de isquemia. Uma suplementação de NO atenua a agressão tecidual intestinal em animais submetidos a I/R 23. Os receptores das células endoteliais quando estimulados por substâncias vasodilatadoras – acetilcolina, substancia P, bradicinina, histamina, ou pelo aumento do fluxo sanguíneo local, induzem a síntese de NO 36. O NO alcança as fibras musculares lisas da camada média do vaso e liga-se ao grupamento heme da enzima guanilato-ciclase. Esta enzima converte o trifosfato de
análise é a responsável pela ação e efeitos vasodilatadores do NO. Taxas elevadas de GMPc determinam uma diminuição de cálcio, redução da força de contração muscular, relaxamento da musculatura, conseqüente vasodilatação e queda da pressão arterial 72. Vasoconstrição localizada induz ao aumento compensatório e liberação local de NO, que modula o relaxamento,
participando do mecanismo de adaptação cardiovascular para a manutenção da pressão arterial 35, 38. Inalação do NO em baixas concentrações exerce efeito atenuante na aderência leucocitária em I/R 62, 68. Em baixas
concentrações, o NO parece ter uma função fisiologia protetora, enquanto que quando produzido em altas doses pode causar agressão intestinal 6. O NO é
sintetizado a partir da L-arginina sob a ação da enzima óxido nítrico-sintetase (NOS) na formação de L-citrulina. As formas eNOS, nNOS, iNOS são
encontradas amplamente nos intestinos.Luo e cols constataram aumento no grau das lesões intestinais em ratos após utilizar L-NAME para bloquear a síntese do NO 60, 69. A arginase compete com a NOS na síntese do NO reduzindo sua concentração tecidual 71. Em condições fisiológicas, NO predomina na microcirculação com efeitos benéficos no intestino, entre eles manter a permeabilidade vascular, reduzir a aderência de leucócitos no
endotélio, inibir a agregação plaquetaria, reduzir a proliferação da musculatura lisa, limpar a circulação dos radicais livres 37, 38, 66, 67. Tem sido demonstrado
que uma suplementação de NO atenua a agressão tecidual intestinal em animais submetidos a I/R 5. O íleo parece ser mais resistente que o jejuno diante da I/R e o teor de NO parece ser o fator responsável por essa
habilidade do íleo. Entretanto nos intestinos de prematuros não se observou aumento nos níveis de NO, apesar de apresentarem grande resistência a injuria 19.
Conquanto a L-arginina exógena não cause relaxamento dependente do endotélio, peptídeos de alto peso molecular contendo arginina (poli-L- arginina) podem fazer 40, 41, 45. Autores observaram que poli-L-arginina induz relaxamento dependente do endotélio em coronárias normais e em re- perfundidas 27, 42, 43, 44. Isso se daria pelo bloqueio exclusivo da ciclooxigenase.
Nosso experimento buscou reproduzir as lesões típicas da ECN utilizando um modelo de H/R em ratos recém-nascidos. Nossa hipótese foi avaliar o efeito da L-arginina no tecido intestinal quando submetido às condições de H/R. Nossas observações constataram que nos animais submetidos exclusivamente a H/R, foram intensas às lesões teciduais intestinais com alteração na estrutura. O grupo que recebeu previamente a L- Arginina revelou agressão tecidual em menor grau. Seria a oferta do
substrato de síntese do NO com a conseqüente produção aumentada e ação vasodilatadora, o fator preservador do tecido intestinal?
Microscopicamente observou-se uma menor densidade de gânglios no bordo anti-mesentérico em contraste com gânglios grandes, extensos e alinhados no bordo mesentério. Entretanto os animais do grupo H/R evidenciaram intensa dilatação vascular e um intumescimento dos gânglios do plexo mioentérico. Tais estruturas estavam subjetivamente mais alargadas ou aumentadas, mas não foram realizadas medidas específicas e essa observação não foi notada nos outros grupos de estudo. Constatou-se, entretanto nos animais do grupo ARG gânglios redondos e grandes no bordo mesentério e pequenos e raros no bordo anti-mesentérico. No grupo CTL os gânglios apresentavam-se abundantes e bem formados, também mais numerosos no bordo anti-mesentérico quando comparado aos outros grupos. As densidades de neurônios nos gânglios do bordo mesentérico foram notadamente maiores. Numericamente os gânglios nervosos apresentaram quantidades estatisticamente diferentes (H/R < ARG < CTL), enquanto que a quantidade de neurônios dentro dos gânglios apresentou diferença estatisticamente significativa somente entre os grupos H/R e CTL. Seriam as alterações do plexo nervoso só observadas mais tardiamente como sugerido por Silva e cols 58?
Sendo a L-arginina um substrato do NO, postulamos que sua oferta aumentaria os níveis de NO tecidual e diante de eventos de H/R os intestinos estariam mais protegidos. As concentrações teciduais de NO nos intestinos foram dosadas. Nossos resultados no íleo confirmaram esse raciocínio. As comparações entre os grupos 1 e 2 e entre os grupos 1 e 3 tiveram diferença significativa, não observado entre os grupos 2 e 3. Ainda no íleo, os animais que receberam L-arginina apresentaram concentrações maiores de NO (16,5
µM ± 4,91) comparadas com os que não receberam (7,3µM ± 2,02) - uma elevação significativa da concentração de NO. No cólon não se observou diferença estatisticamente significativa entre os níveis do NO entre os grupos que receberam e não a L-arginina. Seria esses valores do NO tecidual o que reduz no íleo a lesão intestinal? Essas diferenças de concentração de NO entre os grupos em íleo e não marcante em cólon poderia ser atribuída ao elevado metabolismo e maior vascularização que ocorre no íleo? Chan e cols relatam concentração de NO intestinal muito baixas em ratos prematuros (1µM ± 1,5) e em recém-nascidos a termo (3µM ± 2,5), porem com nível elevado nos ratos de 30 dias (22µ M± 3,5) e acredita num menor atividade ou quantidade de NOS no intestino desses animais 19. Seria o intestino desses
animais recém-nascidos incapazes ou imaturos para sintetizar NO? Haveria NOS disponível ou em condições de sintetizar NO quando a oferta de
substrato fosse alta? Certamente há outros fatores limitantes e concorrentes na síntese do NO70, 73, 74. Há também relatos que o NO não teria papel protetor no intestino de ratos prematuros como tem nos animais mais maduros 19. Em nosso trabalho os ratos a termo apresentaram NO mais elevado que os valores expostos na literatura, e com clara comprovação de menores graus de lesão nos intestinos dos animais que receberam L- arginina. Os valores de MDA obtidos demonstraram que a ocorrência de lesão tecidual (peroxidação lipídica) mais elevada ocorreu no grupo 1 (H/R) que apresentou intensamente mais alta que o grupo 3 (CTL) e significativamente maior que o grupo 2, corroborando com o encontrado por outros pesquisadores 63 .
É difícil determinar quais mecanismos são responsáveis pelo efeito da L-arginina na atenuação das lesões intestinais produzidas pelos eventos de H/R. Postula-se ser pela maior oferta do substrato seguido de produção do NO. Outros mecanismos de estimulo e regulação do NO provavelmente existem e talvez diferentes em cada órgão. O NO é sintetizado por diferentes isoformas de NOS e enquanto o NO produzido pela NOS endotelial parece responder pela manutenção da hemodinâmica intestinal, os efeitos lesivos estão ligados à elevada e continua produção de NO derivado da NOS indutiva
na reoxigenação, são ainda desconhecidos. O presente estudo demonstrou que a oferta exógena de L-arginina a ratos submetidos a eventos de H/R contribui a níveis mais elevados de NO intestinal, menor grau de lesão e alteração na estrutura e acarretando intensidade menor de peroxidação lipídica tecidual. Porem em relação ao plexo nervoso intestinal se constatou que houve variação e redução das estruturas nervosas entre os grupos estudados. O estudo não permitiu assegurar que a proteção intestinal durante a H/R esta relacionada a uma dose dependente e uma maior ou menor concentração do NO produzido pela L-arginina.
6. CONCLUSÃO
Nas circunstancias em que nosso trabalho experimental foi desenvolvido utilizando um modelo experimental de enterocolite necrosante concluímos que a utilização da L-Arginina exógena:
- Não é capaz impedir a ocorrência de lesões intestinais produzidas pela H/R.
- Evidenciou menor grau nas alterações morfológicas encontradas na parede intestinal dos animais que receberam a L-Arginina.
- Revelou diferença estatisticamente significativa quanto a quantidade de gânglios nervosos e ao numero de neurônios dentro dos gânglios do plexo mioentérico e submucoso dos animais estudados.
- Elevou de forma relevante o nível do NO do tecido intestinal no grupo de animais que receberam a L-Arginina exógena.
- Contribuiu para reduzir a peroxidação lipídica intestinal, observada através das analise comparativa das concentrações do MDA nos tecidos dos três grupos estudados.