In vivo ve in vitro sitogenetik testlerin üç farklı tipi klastojeniteyi göstermektedir. Bu ışık mikroskobu testleri kromozomların sayısı veya yapısındaki kimyasal olarak indüklenen değişimleri belirlemek için kullanılmaktadır. Özellikle hücre kültürü adaptasyonları çok daha kullanışlı, ekonomik ve birçok bileşiği görüntüleme kabiliyetine sahiptir. Sitogenetik çalışmaları, çevresel olarak yada çalışma ortamında klastojenlere ve radyasyona maruz kalan belirli populasyonlar için (Barquinero, 1993) ya da bireysel olarak etkilenme dozunu saptamak için kullanılabilmektedir (Fender ve Wolf, 1998;
Sram ve ark., 1998). Kimyasalların mutajenliğini araştırmada kullanılan en yaygın sitogenetik yöntemler, yapısal kromozom aberasyonu (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD) ve mikronükleus (MN) testleridir (Albertini ve ark., 2000). Bu testler in vivo olarak laboratuar hayvanlarında (Desesso ve ark., 2000; Topaktaş ve Speid, 1990), in vitro olarak da insan kan lökositleri, mesane, mide nasal ve sperm hücreleri ile çeşitli kültür hücrelerinde uygulanabilmektedir (Surralles ve ark., 1998).
Kromozom Aberasyonu
Bilinen birçok karsinojen ayrıca kromozom kırılmalarını indükleyen klastojen ajanlar olarak tanımlanmaktadır. CHO ve V79 hücre hatları ve insan lenfositleri kısa zamanlı sitogenetik çalışmalar için yaygınlıkla kullanılmaktadır (Aardema, 2006; Clare, 2006).
Anöploidi ve poliploidi gibi sayısal kromozom bozulmaları ile kromozom tipi, kromatid tipi kırılmalar ve anormal birleşme gibi yapısal bozulmalar çok yaygın olarak, bölünen hücrelerin metafazda olanlarını kolsemid ya da kolşisin gibi bir tübilin polimerizasyon inhibitörü kullanarak tutuklama ile saptanmaktadır.
13
Bu test kısaca hücreler metafaz safhasında incelenerek kromozom hatalarının ortaya çıkarıldığı sitogenetik bir yöntemdir (Akman, 1983; Trosko, 1997).
Mikronükleus testi (MN)
Mikronükleus ölçüm testleri, kromozom aberasyonlarının belirlenmesi için hız ve hassasiyeti bakımından diğer testlerle karşılaştırılabilir. Mikronukleuslar, özellikle de sentromer eksikliğinden kaynaklanan, mitotik hücre bölünmesi boyunca yavru nükleusa başarılı bir şekilde geçemeyen kromozom fragmentlerinden ileri gelmektedir. Analiz özellikle çoğalma özelliği gösteren kültürlerdeki çeşitli bitki ve memeli hücreleriyle kullanılmaktadır. Mikronükleus belirlenmesi için kullanılan protokoller kromozom aberasyonu için kullanılan protokollerle çok az farklılıklar içermektedir (Parry ve Parry, 2006).
Mikronükleus hücre çekirdeğinin dışında sitoplazmada yer alan çekirdek orjinli küçük küresel bir oluşumdur. Mikronükleus içeren hücre sayısındaki artış, maruz kalınan klastojenik (DNA‟yı hedefler, kromozom kırılmalarına neden olur) veya aneujenik (kromozom sayısının değişimine etkilidir, genellikle DNA‟yı hedef almaz) ajanların genotoksik etkilerini yansıtan bir belirteçtir. Mikronükleus testi bölünme yeteneğine sahip tüm hücrelerde yapılabilen bir testtir. Temel prensibi, bazı mitoz anomalileri ve kromozom kaybı gibi durumların ortaya çıkarılmasına yöneliktir (Trosko, 1997; Majone, 1990).
Kısa zamanlı sitogenetik testlerin sınırlamaları
Kültüre edilmiş hücrelerin metabolik biyotranformasyon potansiyelleri eksiktir. Bu da metabolize olmayan temel kimyasalların genotoksisitesinin belirlenmesini sınırlandırmaktadır. Mikrozomal enzim preperasyonları, besleyici katmanlar ve kültür kombinasyonları, metabolize edici enzimlerin eksikliğinde ilave edilebilirler. Kromozom aberasyon testi daha duyarlı ve güvenilir bir test iken, KKD ve mikronükleus testlerinden daha yorucu ve pahalıdır (Barile, 2008).
14 Planlanmamış DNA sentezi (PDS)
Hem in vivo hem de in vitro memeli hücreleri devamlı olarak doğal veya deneysel yollardan kimyasallara maruz kalarak saldırıya uğramaktadırlar. Bu hücreler, evrimsel seçim yoluyla hasarların onarımını gerçekleştiren savunma sistemlerini geliştirmişlerdir. Planlanmamış DNA sentezi işleminin onarım mekanizması iyi tanımlanmıştır. Bu toksikoloji testinin prensibi, test kimyasalları ile muamele boyunca veya sonrasında, kültür hücrelerine [3H]-TdR (3H-Timidin) katılması esasına dayanmaktadır.
Sonraki enzimatik onarım işlemleri, kimyasal saldırının bir sonucu olarak oluşan DNA parçalarının var olduğu hücrelerin tanımlanmasıyla başlatıldığından, planlanmamış DNA sentezi testi DNA hasarının indirekt ölçüm metodudur.
Primer DNA yapısı oluşan parçaların çıkarılması, DNA polimerizasyonu ve sonraki ligasyon işlemleri sayesinde yeniden eski haline dönüştürülmektedir.
Analiz, sırasıyla otoradyografi veya sıvı parlamalarının sayımı ile yarı kantitatif veya kantitatif veri üretmektedir (Williams, 1977).
Hücre transformasyonu
Hücre trasformasyonu için kısa zamanlı testler, kimyasal olarak indüklenen in vivo kanserler için, hassasiyet ve mekanistik olarak geçerli in vitro modelleri içermektedir. Malignant transformasyon, karsinojenik indüksiyon ile ilişkili fenotipik değişikliklere eşlik etmektedir. Testler, test bileşiklerinin karsinojenik potansiyelleri ve transforme kabiliyetlerini (hücresel morfoloji veya büyüme karakteristiklerindeki değişiklikler gibi) tespit etmek için oluşan değişikliklerin sonuçlarını kullanmaktadır.
Testlerin yeniden üretilebilirliğin eksikliği, aşırı çeşitlilik ve bazı sonuçların yorumlamalarında karşılaşılan subjektif yorumlardan kaynaklanan problemleri vardır (Barile, 2008).
15 Fokus transformasyon analizi
C3H/1OT1/2 ve BALB/c 3T3 fibroblast ölümsüz hücre hatları bu analizde kullanılmaktadır. Bu hücreler, özellikle devamlı proliferatif özellikleri ve in vivo tümör oluşturucu eğilimlerinden, ölümsüz memeli kültürlerinin karakteristik yapılarını göstermektedirler. A549 gibi diğer insan ve kemirgen ölümsüz hücrelerinden farklı olarak, insan akciğer karsinoma ve insan kolon karsinomasından (Caco-2) türevlenmiştir. Bu ölümsüz hücreler tek tabaka kültürlerde odaklar oluştururlar (Barile, 2008).
Tip I odaklar malignant olarak transforme olmuş gibi hesaplanmaz; bunlar sıkı paketlenmiş odaklardır ve tek tabaka kültürler, konakçı hayvana inokülasyondan sonra tümör oluşturucu değillerdir.
Tip II odaklar yoğun, üst üste gelen çok tabakalı hücre ağlarını göstermektedir.
Tip III odaklar yoğun bir şekilde boyanmış üst üste gelen çok tabakalı hücre; büyüme modellerinin kenarları düzensiz ve konakçı hayvana enjekte edildiğinde tümör oluşturucudur. Analizin, in vivo oluşan çok aşamalı karsinojenlerin teşvikinin belirlenmesinde ve anlaşılmasında belirli bir değeri vardır.
Kardeş kromatid değişimi (KKD)
Kardeş kromatid değişimi (KKD) kromatidlerin homolog bölgeleri arasındaki replike olan DNA‟nın krossing over olayını içerir. Kromozom aberasyonundan farklı olarak değişim morfolojik değişiklikleri içermez ve kardeş kromatidlerin ayırt edici etiketleme yöntemiyle, değişimi tespit etmektedir.
Transkribe olan DNA‟nın BrdUrd (Bromodeoksiüridin) etiketlemesinin bir boya ile kombine edilmesiyle metod uygulanmaktadır. BrdUrd‟nin hücrelere katılması, S fazındaki hücrelerin fraksiyonlarının kesin olarak tahmin edilmesinde, yalnızca [3H]-TdR uygulanmasıyla yapılan DNA ölçümü işleminden, daha etkilidir.
Optimal metod ise eşzamanlı olarak hem DNA içeriğinin hem de hücrelere katılan BrdUrd‟nin ölçülmesidir. Protokol, kültür medyumuna BrdUrd etiketinin
16
eklenmesi haricinde karyotip analizine ve kromozom aberasyonunun belirlenmesine benzerdir. KKD ve karsinojenite arasında kuvvetli bir korelasyon olduğu kabul edilmektedir. Buna ilave olarak KKD kromozom aberasyonlarının belirlenmesinden daha az zahmetli bir testtir. Bu da KKD testinin, karsinojen ve genotoksik ajanlar için kullanışlı ve dominant bir kısa zamanlı test olduğunu doğrulamaktadır (Barile, 2008).
KKD testi toksik madde-DNA etkileşimini açığa çıkarmadaki duyarlılığı ve genetoksik kimyasalların kültüre edilmiş yada muamele edilmiş hayvanlardan alınan örneklerinde KKD sayısını önemli ölçüde arttırması sebebi ile bireysel olarak maruz kalınan genetoksik karsinojenlerin kan lenfositlerinde yaratığı DNA hasarını belirleyen bir indikatör olarak kullanılmaktadır (Albanesi ve ark., 1998).
KKD yönteminin prensibi, kardeş kromatidlerin birbirine kontrast sağlayacak şekilde boyanmasına dayanır. Kardeş kromatidlerde meydana gelen parça değişimi, boyanma farklılığından hemen anlaşılır. Bu yöntemle sadece kromozomlarda oluşan yapısal değişimler gözlemlendiğinden dolayı KKD yöntemi sınırlı amaçlar için kullanılabilir (Trosko, 1997; Bakale ve Mc Creary;
Galli ve Schiestl, 1996).