Sinoviyal Sıvılarda IL-1β, IL-6, IL-8 ve TNF-α Konsantrasyonlarının

Alınan TME sinoviyal sıvı örneklerinin toplanması sonrasında IL-1β, IL-6, IL- 8 ve TNF-α analizleri Selçuk Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Araştırma Laboratuarı’ nda Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay (ELISA) yöntemi ile Invitrogen™ marka ticari kitler kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 2.11).

Şekil 2.11. Invitrogen Eliza İnceleme Kiti İnterlökin 6 konsantrasyonunun belirlenmesi

Ajanların hazırlanması:

a. IL-6 Standardının Çözdürülmesi ve Sulandırılması

- Standart, 2500 pg/mL olacak şekilde Standart Sulandırıcı Tampon (Standart Diluent Buffer) ile ürün etiketine uygun olarak çözündürüldü. Tam çözünme için 10 dk beklendi.

56 - Çözündürülmüş 200 µl standart 800 µl Standart Sulandırıcı Tampon içeren tüpe aktarılarak 500 pg/mL konsantrasyonda IL-6 standardı (st. 1) elde edildi.

- Daha sonra standart 1’ in ½’ lik seri sulandırmaları sonucu 500; 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6 ve 7,8 pg/mL konsantrasyonda standartlar hazırlandı (Çizelge 2.1).

Çizelge 2.1. IL-6 standart dilüsyonları.

Standart Ekle: İçine:

St. 1 500 pg/ml 200 µl stok std. 800 µl std. diluent St. 2 250 pg/ml 300 µl st. 1 300 µl std. diluent St. 3 125 pg/ml 300 µl st. 2 300 µl std. diluent St. 4 62,5 pg/ml 300 µl st. 3 300 µl std. diluent St. 5 31,2 pg/ml 300 µl st. 4 300 µl std. diluent St. 6 15,6 pg/ml 300 µl st. 5 300 µl std. diluent St. 7 7,8 pg/ml 300 µl st. 6 300 µl std. diluent St. 8 0 pg/ml 300 µl st. 7 Boş Tüp b. Deney Yöntemi

Kuyucuklara 100 μL standart, kontrol ve örnek 50 μL biotin Konjugat ile birlikte eklendi. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak 2 saat inkübasyona bırakıldı, daha sonra yuvalar yıkandı (Şekil 2.12). 100 μL streptavidin-HRP konjugatı yuvaya eklendi ve oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra yuvalar yıkandı. 100 μL Stabilize Kromojen yuvalara eklendi. 30 dakika oda sıcaklığında çalkalanarak inkübasyona bırakıldı. 100 μL stop solüsyonu eklendi ve plaktaki yuvaların absorbansları mikrotitre plaklarının spektrofotometresinde (Biotek- EL 311) 450 nm’ de okundu.

57

Şekil 2.12. Plağın İnkübatöre konulması. İnterlökin 1β konsantrasyonunun belirlenmesi

Ajanların hazırlanması:

a. IL-1β Standardının Çözündürülmesi ve Sulandırılması

- Standart, 2500 pg/mL olacak şekilde Standart Sulandırıcı Tampon (Standart Diluent Buffer) ile ürün etiketine uygun olarak çözündürüldü. Tam çözünme için 10 dk beklendi.

- Çözündürülmüş 100 µl stok standart 900 µl Standart Sulandırıcı Tampon ile dilüe edilerek tüpe aktarıldı 250 pg/mL IL-1β standart (st. 1) elde edildi.

- Sonra bu standarttan ½’ lik seri sulandırmalar hazırlanarak 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8 ve 3,9 pg/mL konsantrasyonda standartlar hazırlandı (Çizelge 2.2).

58

Çizelge 2.2. IL-1β standart dilüsyonları.

Standart Ekle: İçine:

St. 1 250 pg/ml 100 µl stok std. 900 µl std. diluent St. 2 125 pg/ml 250 µl st. 1 250 µl std. diluent St. 3 62,5 pg/ml 250 µl st. 2 250 µl std. diluent St. 4 31,2 pg/ml 250 µl st. 3 250 µl std. diluent St. 5 15,6 pg/ml 250 µl st. 4 250 µl std. diluent St. 6 7,8 pg/ml 250 µl st. 5 250 µl std. diluent St. 7 3,9 pg/ml 250 µl st. 6 250 µl std. diluent St. 8 0 pg/ml 250 µl st. 7 Boş Tüp b. Deney Yöntemi

ELISA plakları ve reaktifler oda ısısına getirildikten sonra, 50 μL standart ve örnek 100 μL biotin Konjugat ile birlikte plak yuvalarına eklendi. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak 2 saat inkübasyona bırakıldı, daha sonra yuvalar yıkandı. 100 μL streptavidin-HRP konjugatı yuvaya eklendi ve oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra yuvalar yıkandı. 100 μL Stabilize Kromojen yuvalara eklendi. 25 dakika oda sıcaklığında çalkalanarak inkübasyona bırakıldı. 100 μL stop solüsyonu eklendi ve plaktaki yuvaların absorbansları mikrotitre plaklarının spektrofotometresinde (Biotek-EL 311) 450 nm’ de okundu.

İnterlökin 8 konsantrasyonunun belirlenmesi Ajanların hazırlanması:

a. IL-8 Standardının Çözündürülmesi ve Sulandırılması

- Standart, 10 ng/mL olacak şekilde Standart Sulandırıcı Tampon (Standart Diluent Buffer) ile ürün etiketine uygun olarak çözündürüldü. Tam çözünme için 10 dk beklendi.

59 - Çözündürülmüş 100 µl stok standart 900 µl Standart Sulandırıcı Tampon ile dilüe edilerek 1000 pg/mL IL-8 standardı (st. 1) elde edildi.

- Sonra bu standarttan ½’ lik seri sulandırmalar hazırlanarak 500; 250; 125; 62,5; 31,2 ve 15,6 pg/mL konsantrasyonda standartlar hazırlandı (Çizelge 2.3).

Çizelge 2.3. IL-8 standart dilüsyonları.

Standart Ekle: İçine:

St. 1 1000 pg/ml 100 µl stok std. 900 µl std. diluent St. 2 500 pg/ml 300 µl st. 1 300 µl std. diluent St. 3 250 pg/ml 300 µl st. 2 300 µl std. diluent St. 4 125 pg/ml 300 µl st. 3 300 µl std. diluent St. 5 62,5 pg/ml 300 µl st. 4 300 µl std. diluent St. 6 31,2 pg/ml 300 µl st. 5 300 µl std. diluent St. 7 15,6 pg/ml 300 µl st. 6 300 µl std. diluent St. 8 0 pg/ml 300 µl st. 7 Boş Tüp b. Deney Yöntemi

ELISA plakları ve reaktifler oda ısısına getirildikten sonra, 50 μL standart, kontrol ve örnekler plak yuvalarına eklendi. 50 μL biotin konjugat eklendi oda sıcaklığında 90 dakika inkübasyona bırakıldı, daha sonra yuvalar yıkandı ve 100 μL streptavidin-HRP çalışma solusyonu yuvalara eklendi. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra yuvalar yıkandı. 100 μL Stabilize Kromojen yuvalara eklendi. 30 dakika oda sıcaklığında çalkalanarak inkübasyona bırakıldı. 100 μL stop solüsyonu eklendi ve plaktaki yuvaların absorbansları mikrotitre plaklarının spektrofotometresinde (Biotek-EL 311) 450 nm’ de okundu.

60

Tümör nekroz faktör α konsantrasyonunun belirlenmesi a. TNF-α Standardının Çözündürülmesi ve Sulandırılması

- Standart, 2000 pg/mL olacak şekilde Standart Sulandırıcı Tampon (Standart Diluent Buffer) ile ürün etiketine uygun olarak çözündürüldü. Tam çözünme için 10 dk beklendi.

- Çözündürülmüş 300 µl stok standart 300 µl Standart Sulandırıcı Tampon ile dilüe edilerek 1000 pg/mL IL-1β standardı (st. 1) elde edildi.

- Sonra bu standarttan ½’ lik seri sulandırmalar hazırlanarak 500; 250; 125; 62,5; 31,2 ve 15,6 pg/mL konsantrasyonda standartlar hazırlandı (Çizelge 2.4).

Çizelge 2.4. TNF-α standart dilüsyonları.

Standart Ekle: İçine:

St. 1 1000 pg/ml 300 µl stok std. 300 µl std. diluent St. 2 500 pg/ml 300 µl st. 1 300 µl std. diluent St. 3 250 pg/ml 300 µl st. 2 300 µl std. diluent St. 4 125 pg/ml 300 µl st. 3 300 µl std. diluent St. 5 62,5 pg/ml 300 µl st. 4 300 µl std. diluent St. 6 31,2 pg/ml 300 µl st. 5 300 µl std. diluent St. 7 15,6 pg/ml 300 µl st. 6 300 µl std. diluent St. 8 0 pg/ml 300 µl st. 7 Boş Tüp b. Deney Yöntemi

- ELISA plakları ve reaktifler oda ısısına getirildikten sonra, 50 μL İnkübasyon Tamponu standart ve serum/plazma örneklerini içeren plak yuvalarına eklendi. Hücre kültürü örnekleri içeren kuyucuklara 50 μL Standart Sulandırıcı Tampon eklendi. Kromojen için ayrılmış kısımlar boş bırakıldı.

61 - Sıfır kuyucuklara 100 μL Standart Sulandırıcı Tampon eklendi. Kromojen için ayrılmış kısımlar boş bırakıldı.

- Uygun mikrotiter kuyucuklara 100 μL kontrol, örnek ve standart eklendi.

- Plate yüzeyleri sarılarak 120 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakıldı.

- Her bir yuvaya (kromojen konjugatlar hariç) 100 μL biotin konjugat eklendi.

- Plate yüzeyleri sarılarak 60 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakıldı.

- Plak yıkama solüsyonuyla tekrar yıkandı.

- Her yuvaya (kromojen konjugatlar hariç) 100 μL strep-HRP eklenip oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakıldı.

- Plak yıkama solüsyonuyla tekrar yıkandı.

- 100 μL Stabilize Kromojen eklenerek 30 dakika inkübasyona bırakıldı.

- Her yuvaya 100 μL TMB stop solüsyonu eklendi, yavaşça çalkalanarak mavi rengin sarıya dönmesi sağlandı.

- Bu işlemden sonra plaktaki yuvaların absorbansları mikrotitre plaklarının spektrofotometresinde (Biotek-EL 311) 450 nm’ de okundu.

62