Siklin-E, PCNA ve p27 Üç Önemli Hücre Siklusu Regülatör Proteinidir

fertilidade (Pickett e Berndtson, 1978, citado por Muiño et al., 2007).

Em um recente trabalho Muiño et al. (2007) realizaram a comparação entre diluidores comerciais sem gema de ovo, Andromed® e Biociphos Plus®, e um diluidor a base de Tris-gema (Biladyl®) com um tempo de equilíbrio a 5ºC de 18 h. Realizaram-se avaliações de viabilidade e integridade acrossomal logo após o descongelamento, e após 3, 6 e 9 h de incubação a 37ºC, utilizando os corantes fluorescentes SYBR- 14, PI e PE-PNA e analisado por um citômetro de fluxo. Os resultados indicaram que quando se utiliza um tempo de equilíbrio de 18 h (congelamento no dia seguinte ao dia da coleta), o uso de diluidores a base de Tris-gema, Biladyl® resulta em maior sobrevivência e longevidade espermática do que diluidores a

base de lecitina de soja, Andromed® e Biociphos Plus®.

4.3.6 Efeitos das taxas de congelamento

A maioria das teorias sobre crioinjúria relaciona-se às conseqüências da formação e dissolução de cristais de gelo, que variam de acordo com as taxas de congelamento. O processo de desidratação que acompanha o congelamento lento está potencialmente associado com a sobrevivência celular, enquanto que no congelamento a taxas rápidas a probabilidade de morte celular é maior. Para o espermatozóide a taxa ótima de resfriamento entre −5ºC e −45ºC está entre 10ºC/min e 80ºC/min (Watson, 1995). Os protocolos de criopreservação de sêmen normalmente têm utilizado taxas de congelamento que variam desde 10 a 100ºC/min, obtendo-se boas taxas de sobrevivência pós-criopreservação (Agca e Critser, 2002, citado por Gonzalez 2004). O resfriamento dos espermatozóides abaixo de 0ºC (congelamento), em uma taxa lenta promove maior egresso da água da célula do que quando o resfriamento é realizado numa taxa rápida. Dessa forma um resfriamento muito lento pode levar a uma desidratação celular muito intensa, enquanto, um resfriamento muito rápido é insuficiente para permitir o egresso da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular. A taxa de resfriamento ideal deve ser relativamente rápida resultando em suficiente e não excessiva retirada de água intracelular, o que pode levar a formação de cristais de gelo intracelulares, pequenos e não letais, proporcionando boas condições de sobrevivência da célula após o reaquecimento (Amann e Pickett, 1987; Celeghini, 2005).

Quando o sêmen diluído é resfriado abaixo da temperatura de 5ºC, inicialmente o meio diluidor ao redor do espermatozóide, e as

próprias células, encontram-se não congeladas, porque os pontos de congelamento dos diluidores (devido aos crioprotetores) e do líqüido intracelular estão abaixo de 0ºC. Ocorre então um fenômeno chamado de super-resfriamento. Entre as temperaturas de −5ºC e −15ºC, dependendo da curva de congelamento e do diluidor, começam a se formar cristais de gelo no diluidor, enquanto os espermatozóides permanecem super-resfriados. Ocorre então o aumento da concentração de solutos ao redor do espermatozóide e do gradiente osmótico culminando com a desidratação da célula (Amann e Pickett, 1987; Snoeck, 2003).

Em pesquisa realizada por Chen et al. (1993), foi testado o efeito do super- resfriamento (−13 ou −14ºC antes do congelamento até −196ºC) e da indução da formação de cristais de gelo (“seeding”) no sêmen de touros sobre a motilidade pós- descongelamento de sêmen em diluidores a base de Tris-gema e leite integral. Este experimento demonstrou que os espermatozóides são mais sensíveis a mudanças de temperatura quando congelados com leite integral do que em Tris-gema, na faixa entre −50 a −75ºC (temperatura de transferência para o nitrogênio). Esse estudo revelou que os espermatozóides passam por uma fase de super-resfriamento semelhante ao que ocorre aos embriões durante o congelamento. Os efeitos sobre a motilidade foram menores quando o sêmen diluído foi submetido ao “seeding”, mas esses efeitos foram avaliados apenas imediatamente após o descongelamento. As taxas de congelamento de −15, −25 e −35ºC/min foram semelhantes em relação à sobrevivência espermática e foram superiores ao congelamento a −5ºC/min.

Em geral é aceito que a resposta ao congelamento é influenciada principalmente pela permeabilidade da célula à água e aos solutos. Devido a isso, para entender a

criobiologia do sêmen, nas décadas anteriores um considerável esforço foi realizado na tentativa de determinar as características de permeabilidade dos espermatozóides de várias espécies (Leibo e Bradley, 1999).

Agca e Critser (2002) e Leibo e Bradley (1999) relataram que as pesquisas têm sido direcionadas no sentido de otimizar os protocolos de criopreservação quantificando alguns parâmetros biofísicos como o coeficiente de permeabilidade da membrana celular para a água (Lp), para o crioprotetor (Pcpa) assim como a sua energia de ativação (Ea). Estes parâmetros têm sido determinados em espermatozóides de várias espécies de mamíferos e utilizados na tentativa de predizer o tipo e a concentração ótima do crioprotetor, a velocidade de adição e de retirada do crioprotetor, além da taxa de congelamento e descongelamento. Porém, os resultados obtidos têm deixado dúvidas a respeito da importância da velocidade de passagem da água pela membrana na determinação da taxa de resfriamento ideal, já que as técnicas utilizadas superestimam os valores (Leibo e Bradley, 1999; Gonzalez, 2004).

Entretanto outros trabalhos como os realizados por Devireddy et al. (1999, citado por Leibo e Bradley, 1999), e por Chaveiro et al. (2006), utilizando técnicas diferentes de medição dos valores de Lp e de Ps (coeficiente de permeabilidade para o glicerol), obtiveram valores próximos aos valores obtidos empiricamente.

No trabalho realizado por Chaveiro et al. (2006), concluiu-se que existem diferenças significativas entre touros na Lp e Ps da membrana plasmática do espermatozóide. Isto indica que machos diferentes podem requerer ajustes nos protocolos de congelamento. A aplicação desses dados em um modelo teórico para simular os eventos osmóticos durante o congelamento resultou na predição de taxas de congelamento que se

situam na mesma faixa dos valores obtidos empiricamente.