KAVRAMSAL ÇERÇEVE GİRİŞ
2.1. Okuma Becerisi
2.2.3. Sesli Okuma Hataları
5.1. Modelo de digestão gastrointestinal in vitro
Este modelo, que visa a mimetização da digestão, é baseado nas diferentes condições fisiológicas do tracto gastrointestinal. Para além da composição química dos fluídos digestivos, teve-se em conta outros factores como a temperatura (37 °C), o pH e o tempo de residência em cada um dos compartimentos (a boca, o estômago e intestino delgado). O modelo utilizado foi baseado em publicações prévias, com algumas modificações [91,92].
A composição das soluções stock, que simulam os diferentes sucos fisiológicos, saliva, gástrico, duodeno e bilis, encontram-se descritas na Tabela 8.
Para os ensaios de digestão in vitro foram preparados dois ensaios diferentes, designados de digestão na ausência de enzimas e digestão na presença de enzimas (Vide Tabela 8). As soluções stock utilizadas nos ensaios foram preparadas da mesma forma, porém o ensaio da digestão na ausência de enzimas foi privado da adição dos complementos enzimáticos
.
O processo de digestão in vitro foi realizado em duplicado.Os liofilizados (aproximadamente 2 g) foram colocados em tubos tipo falcon e incubados a 37 °C num banho de água, com agitação e ao abrigo da luz. A simulação da digestão ocorreu sequencialmente da seguinte forma: boca – adicionou-se 4 mL de solução stock de saliva e incubou-se durante 5 minutos; estômago – adicinou-se 10 mL da solução stock de suco gástrico e deixou-se em agitação durante 2 horas e intestinos – adicionou-se 10 mL de solução stock duodenal e 4 mL de solução stock de bílis e deixou-se em agitação durante 2 horas. No ensaio da digestão na presença de enzimas o procedimento foi o mesmo, no entanto as soluções stock continham os complementos descritos na Tabela 8.
Após a simulação do processo de digestão in vitro, os tubos foram colocados a - 20 °C para posterior liofilização e extracção, de acordo com a secção 3, da “Metodologia experimental”.
Tabela 8 - Composição das diferentes soluções stock, utilizadas na digestão gastrointestinal in vitro, com os respectivos componentes, os complementos e o diferente pH de cada meio fisiológico do organismo.
Soluções stock
Componentes Saliva Suco gástrico Duodenal Bílis
Água destilada 500 mL 500 mL 500 mL 500 mL NaCl 58,50 mg 2,75 g 7,03 g 5,27 g KCl 74,50 mg 0,82 g 0,57 g 0,38 g NaHCO3 1,06g - 3,39 g 5,79g CaCl.2H2O - 0,40 g - - NaH2PO4 - 0,266 g - - KH2PO4 - - 80,30 mg - NH4Cl - 0,306 g - - MgCl2 - - 50,40 mg - Ureia 0,20 g 0,09 g 0,10 g 0,26 g HCl concentrado - 6,50 mL 0,15 mL 0,15mL Complementos - 0,50 g de mucina 2,50 g de pepsina 9,02 g de pancreatina 12,01 g de sais biliares - 1,06g de
α-amilase 3,00 g de mucina 1,50 g de lipase - pH8
- 6,8 1,30 8,1 8,2
5.2. Determinação do conteúdo de fenólicos (TPC) e flavonóides totais
(TFC) e da actividade antioxidante in vitro dos extractos
Estes ensaios foram realizados da mesma forma, quer nos extractos não digeridos, quer nos extractos obtidos pelos ensaios da digestão in vitro.
5.2.1. Conteúdo de fenólicos totais (TPC)
O conteúdo de compostos fenólicos das amostras foi determinado pelo método colorimétrico Folin-Ciocalteu, descrito por Zheng e Wang (2001) [93], com algumas modificações [94]. Este estudo foi levado a cabo utilizando um espectrofotómetro PERKIN ELMER UV-Vis (Germany), controlado pelo software Lambda 2.
Adicionou-se 50 µL de extracto (5 mg/mL) a 1,25 mL de reagente Folin-Ciocalteau (diluição na proporção de 1:10, em água destilada) e 1 mL de Na2CO3 (7,5%, m/v). Agitou-se a mistura e incubou-se à temperatura ambiente, durante 30 minutos, na ausência de luz. A absorvância foi medida aos 765 nm usando o espectrofotómetro UV-Vis. Todos os ensaios foram realizados em triplicado (n = 3).
O ácido gálico (GA) foi utilizado como padrão, deste modo os resultados foram expressos em miligramas de equivalente de ácido gálico por grama de extracto (mg GAE/ g de extracto). Assim, para a construção da recta de calibração, procedeu-se do mesmo modo nas diferentes concentrações do ácido gálico.
5.2.2. Conteúdo de flavonóides totais (TFC)
O conteúdo de flavonóides totais foi avaliado pela utilização do método colorimétrico de cloreto de alumínio de acordo com Akkol et al. (2008) [95], com algumas modificações [94].
Resumidamente, 0,5 mL do extracto de cada extracto (5 mg/mL) foram misturados com 1,5 mL de metanol, 2,8 mL de água destilada, 0,1 mL de acetato de potássio (CH3COOK, 1 M) e 0,1 mL de cloreto de alumínio (AlCl3.6H2O, 10% em metanol). A mistura ficou a reagir durante 30 minutos na ausência de luz e a absorvância foi medida a 415 nm.
Procedeu-se da mesma forma com soluções de rutina (substância padrão) em diferentes concentrações, para a construção da recta de calibração. Todos os ensaios foram realizados em triplicado (n = 3). Os resultados foram expressos em mg equivalente de rutina por grama de extracto (mg RE/ g extracto).
5.2.3. Actividade antioxidante in vitro
Ensaio ABTS
+
A capacidade antioxidante pelo método ABTS foi realizada de acordo com Re et al. (1999) [96], com algumas modificações [94]. Misturou-se 50 mL de solução ABTS (2 mM)com 200 µL de de solução persulfato de potássio (70 mM) para a formação do radical ABTS+. Esta mistura permaneceu 16 h à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Antes da sua utilização, diluiu-se em tampão fosfato salino (PBS pH 7,4), de forma a obter a absorvância de 0,700 ± 0,021 a 734nm.
Para a determinação da capacidade da actividade antioxidante dos extractos metanólicos, fez-se reagir 40 µL de cada um dos extractos (5 mg/mL9) com 980 µL da solução ABTS+ e mediu-se o decaimento da absorvância durante 6 minutos, a 734 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicado (n = 3). O Trolox foi utilizado como padrão e os resultados foram expressos em milimol de equivalente de Trolox/g de extracto (mmol TE/ g extracto).
Ensaio DPPH
O método DPPH foi realizado segundo o descrito por Gordon et al. (2001) [97], com algumas modificações [94]. De um modo geral, este ensaio foi realizado pela adição de 100 µL de soluções dos extractos metanólicos (5 mg/mL10) a 3,9 mL de solução DPPH (0,06 mM em metanol). Após 30 minutos a reagir, à temperatura ambiente e ausência de luz, a absorvância foi medida aos 516 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicado (n = 3). O Trolox foi utilizado como padrão e os resultados foram expressos em milimol de equivalente de Trolox/g de extracto (mmol TE/ g extracto).
9 Os extractos foram preparados na concentração (m/v) de 5 mg/mL, porém em alguns casos foi necessários proceder a diluições.
10 Os extractos foram preparados na concentração (m/v) de 5 mg/mL, porém em alguns casos foi necessários proceder a diluições.