Serolojik testler

Toxoplasmosis tanısında uygulanan serolojik yöntemleri, kullanılan antijene göre sınıflandırıp incelemek daha doğrudur. Çünkü Toxoplasma antijeninin özelliğine göre hasta veya şüpheli organizmada oluşan antikorlar aranacaktır. Eğer antikorlar aynı olursa o zaman kullanılan yöntemlerin sonuçlarının da birbirine çok yakın olması gerekecektir.

Serolojik tanı yöntemlerinden en fazla kullanılan ve sonuçlarına güvenilen metodlar: 1) Sabin-Feldman boyama yöntemi veya Dye test (SFDT), 2) İndirekt Fluoresan Antikor Testi (IFAT), 3) Kompleman birleşmesi testi (KB), 4) Direkt ve indirekt hemaglütinasyon testi (IHA), 5) Enzim işaretli antikorlarla yapılan ELISA testi (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), 6) Modifiye aglütinasyon testi (MAT), 7) Lateks aglütinasyon testi (LAT), 8) Direkt aglütinasyon testi (DAT).

Bu yöntemlerden SFDT ve IFAT yöntemlerini uygularken Toxoplasma trofozoitlerinin kendileri antijen olarak kullanılırlar. Her iki yöntem için, laboratuvarda Toxoplasma infeksiyonunun farelerde devam ettirilmesi gereklidir. Her iki yöntemde de antijenin taze hazırlanması ve kullanılması tercih edilir.

32

1.5.2.1. Sabin-Feldman boyama yöntemi (dye-test)

Bu test ilk olarak 1948 yılında Sabin ve Feldman tarafından tarif edilmiştir. Hasta veya şüpheli kişi serumunda Toxoplasma trofozoit şekillerine karşı oluşan antikorların araştırılmasında kullanılır. Bu test canlı Toxoplasma trofozoit şekillerinin antikorla karşılaştıkları zaman Aktivatör faktör yardımıyla ve alkali ortamda metilen mavisi ile boyanmamaları, antikor olmadığı zaman ise boyanmaları esası üzerine kurulmuştur (Özcel ve Sermet 1983).

SFDT bugüne kadar Toxoplasmosis tanısında en güvenilir ve duyarlı bir yöntem olarak yerini korumuştur. Akut ve kronik Toxoplasmosis olgularında sonuçlara güvenilmesi ve başka hastalıklarla çapraz reaksiyon vermeyecek kadar özel olması dolayısıyla olanakları yeterli olan laboratuvarlar halen birinci derecede bu testi uygulamaktadırlar. Testin uygulanmasında canlı Toxoplasma trofozoit şekillerinin antijen olarak kullanılması, birçok araştırıcı tarafından tehlikeli ve kullananlar için riskli bulunduğundan laboratuarlarda devamlı uygulamadan kaçınılmaktadır. Ayrıca komplemana benzeyen ve ancak bazı normal serumlarda yeterli düzeyde bulunan Aktivatörün bulunması kolay

olmadığından bu testin uygulanması sınırlı kalmaktadır (Özcel ve Sermet 1983). Sabin-Feldman boya testinde antijen hazırlamak için, canlı Toxoplasma

trofozoitleri 3 gün önce intraperitoneal yolla enfekte edilen beyaz laboratuar farelerinin periton sıvısından elde edilir. Fare periton sıvısında çok miktarda canlı Toxoplasma bulunması gereklidir. Bu şekildeki fare periton sıvısı doğrudan antijen olarak kullanılmaktadır. Bu testte boya olarak metilen mavisinin %96 lık alkol içindeki %2'lik eriyiği, antikorla karşılaşmayan Toxoplasma takizoitlerinin mavi renge boyanmasında kullanılır. Aktivatör serum, komplemana yakın özelligi olan ve her normal insan kanında yeterli düzeyde bulunmayan bir faktördür. Unat’a göre (39) properdin, magnezyum ve komplemanın bazı fraksiyonlarından oluşmuştur. Remington ve Strannegard’ın çalışmalarına göre, antikor bulunan ortamda aktivatör faktör antikorların parazit zarına tutunmasına ve parazit zarının yer yer eritilmesine sebep olmaktadır (26. 29). Aynı çalışmalarda properdin’e benzeyen bu faktörün ısıya dayanıklı olmadığı, ısıtılan serumların aktivatör özelliğini kaybettiği, ısıtılmamış serum ilavesiyle bu özelliğin geri geldiği invitro ve invivo sistemlerde gösterilmiştir.

33

Test sonunda, boyanmış takizoitler koyu mavi olarak görünürler, sitoplazmanın kısmi lizisinden dolayı daha yuvarlaklaşmışlardır. Boyanmamış takizoitler ise ilk şekillerini korurlar.

Antikorla birleşen takizoitler alkalen metilen mavisi ile boyanmazlar ise sonuç olumludur (pozitiftir). Serumda antikor yoksa takizoitler koyu mavi renge boyanırlar ve yuvarlaklaşırlarsa sonuç negatiftir. Test sonuçlarının mikroskobik incelemeyle okunmasında takizoitlerin hem boyanmasına hem de şekillerindeki değişikliğe dikkat edilir. Negatif olgularda mikroskop sahasında görülen takizoitlerin hangi oranda boyanmış görülebilecekleri testi uygulayan laboratuar veya araştırıcının deneyimine göre değişebildiği gibi bu durum bilinen pozitif serum ve negatif serum ve dilüsyonları ile kontrol edilir. Genelde, mikroskop sahasında görülen takizoitlerin %60 veya daha fazla oranda boyanması sonucun negatif olması için yeterlidir. Sonuçta 1/64 ve daha yukarı dilüsyonlardaki pozitif görünüm toxoplasmosis tanısı için yeterli sayılmaktadır.

SF testi uygulamalarında Remington ve arkadaşları (26) bazı ufak değişiklikler yapmışlardır. Testin uygulanışına iyice alışkın olan ve deneyimi bulunan kişiler tarafindan metilen mavisi kullanılmadan da test uygulanabilmekte, antikorla Aktivatör serum ortamında karşılaşan takizoitlerin hücre zarındaki değişikliğe ve sitoplasmadaki vakualizasyona bakılarak sonuç okunmaktadır. Çok deneyim gerektiren bu uygulama yanlış yorumlara sebep olabileceği gerekçesi ile pek kullanılmamaktadır.

1.5.2.2. ELISA yöntemi (Enzim İşaretli Anti-globulinlerle Antikor Araştırılması)

Bu yöntem ilk olarak Engvall ve Perlmann tarafindan açıklandıktan sonra (1971), eriyik antijenlerle yapılan diğer testlerin bir karışımı ve en iyisi olarak bildirilmiştir. Antijen olarak canlı takizoitlerden hazırlanan eriyik antijen veya laboratuar ortamında rekombinant DNA teknolojisi uygulanarak hazırlanan rekombinant proteinler kullanılır. Antijen materyali karbonat-bikarbonat tampon solüsyonu (pH 9.6) ile sulandırılarak kullanılır. Sulandırma derecesi bir seri deneyimle bilinen pozitif serumun sulandırma dereceleri ile önceden saptanırsa test hem daha çabuk uygulanır, hem de sonuçlara daha çok güvenilir. Antijen 1cm3 de 5 mikrogram protein bulunacak şekilde sulandırılır. Testin uygulanışında

34

polystrene hemaglütinasyon plakları kullanılır. Bu plaklardaki çukur diplerinin düz olmasına dikkat edilir. 1) polystrene plak çukurları içine önce belli oranda sulandırılmış antijenden 100 mikrolitre konur. Antijenin, polystrene tarafindan yeterli düzeyde emilmesi, diğer bir deyişle polystrene çukurlarının antijenle yeterli şekilde kaplanabilmesi için, buzdolabında 24 saat veya 37ºC de 2-3 saat bekletilir. Bu şekilde antijen bulunun plaklar buz dolabında kullanılıncaya kadar (1 hafta) bekletilebilmektedir. 2) Antijen bulunun çukurlar, kullanılmadan önce fosfat buffer tampon (PBS, içinde % 0.5 oranında Tween 20 olması gereklidir) ile mümkünse otomatik yıkama makinesi ile 3 kez, bu makina yoksa her çukur 3 kez, 3 dakika beklenerek tampon solüsyon pipetle konup emilmek suretiyle yıkanır. PBS içine Tween 20 yerine %0.02 sodium azide kullanılabilir. 3) Çukurlar içine şüpheli serum, pozitif serum, negatif serum çeşitli sulandırma derecelerinde ve en dış sıradaki çukurlara da sadece PBS konur. Bu şekildeki plaklar 37ºC de 30 dakika-2 saat etüvde ve bazı araştırıcılara göre oda ısısında bekletilir. 4)Plaklar tekrar PBS- Tween 20 karışımı ile önceki gibi 3 kez otomatik olarak veya pipetle yıkanır. 5) Enzim işaretli, (Peroxidase veya Alkaline fosfatase) tavşandan elde edilmiş anti-insan/hayvan türü polivalan globulin veya anti-insan/hayvan türü IgG kullanılabilir. Günümüzde daha çok polivalan enzim işaretli anti-insan/hayvan türü globulinlerinin kullanılması tercih edilir. Peroxidase işaretli anti-globulin antikorları ile, alkaline fosfatase işaretli anti-insan/hayvan globulinlerin kullanılması testi uygulayan araştırıcının deneyimine bağlı olmaktadır. Çalışmalar, alkaline fosfatase ile işaretli antiglobulinlerle daha kuvvetli ve görülebilen renk değişikliği elde edildiğini göstermiştir. Bu şekilde enzim işaretli anti-globulinin genellikle 1/500 veya 1/1000 oranında sulandırılmış solüsyonu kullanılır. Bu solüsyondan her çukura yine 100 mikrolitre konur. Enzim işaretli anti-globulinlerin sulandırılmasında PBS ve %1 lik sığır serum albumini veya %3 yağsız süt tozu kullanılmaktadır. Enzim işaretli anti-globulinlerin çukurlara konmasından sonra, plaklar 37°C lik etüvde 2 saat veya oda sıcaklığında 3 saat bekletilirler. 6) Plak çukurları tekrar aynı şekilde 3 kez yıkanır. 7) Bu kez plak çukuraları içine enzimle renk reaksiyonu verebilecek substrat hazırlanır. Peroxidase için 80 mgr 5- amino salisitik asit 80 °C de ml saf su içinde eritirlir ve 1 N NaOH ile pH 6.0'ya ayarlanır. Bu solüsyondan 9 kısım içinde 1 kısım %0,5 H2O2 ilave edilerek substrat hazırlanmış olur. Alkaline fosfatase enzim için: 1 mgr P-Nitrofenilfosfat, 1 ml diethanolamine buffer pH 9.8 içine konarak

35

hazırlanır. Bu hazırlanan substat solüsyonundan enzime göre hangisi uygun ise ondan 100 µl miktarında çukurlar içine konur ve peroxidase için oda ısısında 1 saat, alkaline fosfatase içinse 30 dakika beklenir. Ortama her iki enzim için de geçerli olan, 1N NAOH veya 2 mol NaOH solüsyonundan 25- 50 µl, her çukur içine konarak bu enzimatik olay durdurulur. 8) Plak çukurları içinde pozitif olgu peroxidase kullanıldığında açık kahverengi, alkaline fosfataz kullanıldığında sarı yeşil renk görülmektedir. Bu rengin değerlendirilmesi 1979 yılına kadar gözle yapılırken, daha sonra piyasaya sürülen otomatik spektrofotometre olarak takdim edilen multiskan ile değerlendirilmeye başlanmıştır. Bu makine içine konan hemaglütinasyyon plakları çukurları içindeki renk ayırımları, sayısal değerler halinde, pozitif, negatif serumlar ve PBS çukurları değerleri ile karşılaştırmak suretiyle, şüpheli serumların pozitif değerleri saptanmaktadır. Multiskan adı verilen bu spektrofotometre 5 dakikadan daha az zamanda 96 çukurdaki renk değerlendirmelerini kolonlar halinde yazılı olarak vermektedir (Özcel ve Sermet 1983).

ELISA testi daha ileri çalışmalar için de uygun bir yöntem olarak uygulanmaya başlamıştır. Bu çalışmalardan ilki, bilinen Toxoplasma antikorlarının, polystyrene plaklara emdirilerek, Toxoplasmosis tanısında antikor oluşmasından önce tanıya olanak verebilecek, kan serumunda Toxoplasma antijeni araması çalışmalardan başarı ile kullanılmıştır. Bu gün parazit antijen fraksiyonlarından hangilerinin koruyucu tipte antikor oluşturabildiği konusu, immüno- parazitoloji çalışmalarının esasını oluşturmaktadır. Bu maksat için tek koloni antikorlarından faydalanılmaktadır. Toxoplasma antijenleri ile immunize edilen fare dalak hücreleri ile füzyona başlıyan myoloma hücrelerinden elde edilen tek koloni antikorlarından hangisinin invitro ve invivo ortamda Toxoplasma trofozoitlerini öldürdükleri bir seri deneyle araştırıldıktan sonra, bu tek koloni antikoru, polyestryrene hemaglütinasyon plak çukuruna emedirilir. Bir seri Toxoplasma antikoru fraksiyonları sulandırılarak, bu antikorla antikor hangisinin reaksiyon verdiği saptanabilmektedir. Bu çalışmalar henüz başlangıç safhasında olup çok özel antikor ve antijen araması çalışmaları gerçekleşebilecek kanısındayız.

Paraziter hastalıklarda aşı hazırlanması için koruycu antikor oluşturan antijen fraksiyonlarının bulunup ortaya çıkarılmasında IFAT ve ELISA tekniği invitro

36

deneyimlerle birlikte kullanılmaya başlanmıştır. Bir kez bu şekildeki antijen fraksiyonu bulunduktan sonra, bu gün DNA teknolojisi ve rekombinant DNA yöntemleri ile bu özel antijenlerin üretilmesi ve sonuçta aşı hazırlanabilmesi mümkün olabilmektedir.