1.9.3.1. Agar jel Ġmmünodiffüzyonu (AGID)
Agar jel Ġmmünodiffüzyon testi jel içerisinde antijen ve antikor moleküllerinin diffüz olarak yayılmaları ya da elektrikli ortamda belirli yöne hareket ettirilerek birleĢmeleri sonucu presipite olarak görüntülenme esasına dayanmaktadır (ErganiĢ ve Ġstanbulluoğlu 1994).
Bu yöntemde; R.equi suĢlarının büyük çoğunluğunun sahip olduğu membranolitik ekzoenzimlere karĢı tetikleyici olan antikorların saptanmasıdır (Giguere ve Prescott 1997). R. equi sahip olduğu membranolitik ekzoenzimler kolesterol oksidaz, kolin fosfohidrolaz ve fosfolipaz C‟den oluĢmakta ve equi faktör olarak isimlendirilmektedir. Taylarda doğumun itibaren beĢ aylık oluncaya kadar 2 hafta aralıkla yapılan AGID testi bazen erken tanıda baĢarılı olabilmektedir. Ancak enfekte tayların çok azı AGID ile belirlenebilecek düzeyde antikor oluĢturabilmektedir (Giguere ve Prescott 2014). Bu yöntemin bir diğer dezavantajı da maternal antikorlaradan kaynaklanan yalancı pozitifliktir (Gaskin ve ark 1990).
1.9.3.2. Rhodococcus equi Opsonizasyon Testi
Süpheli serumların opsonik kapasitelerini belirlemek amacı ile uygulanan bir test olup opsonin-fagositoz süresi belirlenmeye çalıĢılmaktadır. R. equi için bu teste klinik açıdan sağlıklı olan atlarda polimorfonükleer lökositler tarafından fagosite edilmiĢ R. equi sayısı sayılarak serumun opsonik kapasitesi belirlenir (Prescott 1991, Cauchard ve ark. 2004).
42 1.9.3.3. Westernblot Analiz Testi
Westernblot analiz testi; araĢtırılacak etkenin (bakteri, virüs, kanserojenik doku) protein çözelitisinde belirlenen spesifik protein olup olmadığını ve ne oranda bulunduğunu belirlenmesi oluĢturur. ġüpheli etkeni içeren örnekler ve kontrol örneği jel katmanının belirlenen noktasına yerleĢtirilir. Elektrik akımı ile numunelerdeki proteinlerin jel boyunca hareket etmesi sağlanır. Böylece proteinler Ģekil ve büyüklüklerine göre ayrılmıĢ olurlar. Bakıldığındaportatif merdivenin basamaklarına benzer bantlar görülür, devamında süpheli numuneler ince bir membranın üstüne aktarılır. Membrana bağlanmıĢ proteinlerin tespiti içinde süpheli patojene karĢı oluĢan ve iĢaretlenen antikorlar kullanılır.
R. equi için bu test metodunda; VapA içeren saflaĢtırılmıĢ R. equi protein çözeltisi elektroforez jelleri ile ayrılmıĢtır. Daha önceden belirlenen VapA ve R. equi karĢı oluĢan iĢaretli antikorlar aracılığı ile hem VapA hem de R. equi gösterilir (Cauchard ve ark 2004).
1.9.3.4. Sinerjik Hemoliz Baskılanması (SHI)
R. equi’nin equi faktörü, C. pseudotuberculosis„in fosfolidaz D‟si, S. aureus‟un beta toksini ve L. monocytogenes’in hemolizini ile sinerjik oluĢturarak memeli eritrositini hemoliz eder. Bu özellik R. equi hızlı idendifikasyonu için kullanılan testlerin temelini oluĢturmaktadır (Linder ve Bemheimer 1982, Prescott ve ark. 1982, Timoney ve ark. 1988, Takai ve ark. 1991b, Takai ve ark. 1991c, Hondalus 1997, Giguere ve Prescott 1997, Weinstock ve Brown 2002, , Puthucheary ve ark. 2006, Sönmez 2007). R. equi’nin equi faktörüne karĢı antikor varlığı sinerjik hemolizin baĢkılanması ile sonuçlanacaktır. Bu test metod ile doğal olarak R. equi pnömonisine yakalanan taylar ile sağlıklı tayları ayırt edilebilinmiĢtir (Prescott ve ark 1984). Fakat, deneysel olarak enfeksiyon oluĢturulan taylarda hastalığın erken evresindeki tayların tanımlanmasında baĢarısız olunmuĢtur. Daha duyarlı bir SHI testi ile taylarda subklinik enfeksiyon tanımlanmıĢtır (Skalka ve Svastova 1985).
43 1.9.3.5. Rhodococcus equi Supernatant Protein Deri Testi
R. equi‟nin hücre duvarı karakterislik olarak tek bir lipitten, lipoproteinlerden ve glikolipidlerden oluĢmaktadır. Makrofajların içine fagozomla girerek hayatta kalabilmektedir ve akciğerde özellikle de taylarda pyogranülomatöz lezyonlara neden olmaktadırlar. Hücreiçi bakteri oluĢu ve hücre duvarının yapısı ile Mycobacterium tuberculosis’e benzerlik göstermektedir. R. equi’den elde edilen supernatant protein antjenleri ile deri testi antijeni hazırlanmıĢtır (Al-Salihi 2011). R. equi‟nin avirülent suĢunun toprakta çok yaygın olmasından dolayı özellikle yaz aylarında tozlu ve kuru havalarda virülent suĢlar kadar avirülent R. equi suĢların taylar ve yetiĢkin atlar tarafından oral veya solunum yolu ile alınması gerçekleĢmektedir. Bu nedenle, bu testte R. equi’nin avirülent suĢunuda alan konakçılarda pozitif sonuç vermektedir.
1.9.3.6. Enzim Bağımlı Ġmmünoserbent Assay (ELISA)
ELISA, antijen-antikor iliĢkisini, antikora bağlanmıĢ bir enzimin aktivitesini araĢtırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Test metodun temelini 1960 yılında Solomon Aoron Berson ve Rosalyn Sussman tarafından geliĢtirilen RIA (Radioimmunoassay) oluĢturmaktadır. RIA yönteminde radyoaktif ajanlarla iĢaretlenmiĢ antijen, bu antijene bağlanabilen belirli miktarda antikor ile karıĢtırılır. Bu karıĢıma hasta serumu eklenir. Hasta serumundaki antijen ile radyoaktif etiketli antijen yarıĢmalı olarak antikor ile birleĢmeye çalıĢırlar. Antijen-antikor kompleksindeki isaretli antijen ile serbest haldeki isaretli antijenlerin oranı ölçülür. ELISA yöntemide RIA‟daki antijen ve antikorların sıvı ortamdaki hareketsiz partiküllere bağlanma yeteneği gözlemlenerek geliĢtirilmiĢtir. ELISA metodunda antijenlerin yanı sıra antikorlarda ölçümde kullanılabilinmektedir. Ayrıca radyoaktif ajan kullanılmadığı için maliyeti daha düĢük ve daha kolay test metodudur.
R. equi „ye karĢı hümoral bağıĢıklık yanıtının ölçülmesinde dört farklı ELISA temel olarak belirlenmiĢtir. Bu dört farklı ELISA metodu farklı antijenler kullanılarak geliĢtirilmiĢtir. Kullanılan antijenlerden biri ATCC 6939 tip suĢudur (Giguere ve Prescott 1997, Vanniasinkam ve ark. 2001). Bu ELISA metodunda
44 avirülens R. equi suĢları tanımlanmıĢtır (Takai ve ark. 1986, Giguere ve ark. 2003). Kullanılan diğer antijen 33701 suĢu dur. Bu ELISA metodunda ise virülens plazmit içeren R. equi ortaya konmuĢtur. Son olarak ELISA VapA‟da R. equi dominant antijenik determinantı rekombinant VapA proteini kullanılırken, ELISA California metodundada R. equi suĢlarının klinik izolatların süpernanatları antijen olarak tanımlanmıĢtır (Giguere ve ark. 2003). Bu test metotlarından en ideallerinin ELISA California ve ELISA VapA olduğu çeĢitli çalıĢmalarla gösterilmiĢtir. VapA protein sahip R. equi suĢların makrofajlarda canlı kalabildiği bölünebildiği ve taylarda hastalık tablosunu oluĢturduğu kanıtlanmıĢtır (Giguere ve ark. 1999). ELISA ile yarı saf VapA proteine karĢı oluĢan ciddi antikor titresinin ölçülebilmesidir (Vanniasinkam ve ark. 2001).