Serbest, Ca-aljinat, Ba-aljinat, aljinat-poliakrilamit, poliakrilamit kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin maksimum aktifliğinin zamanla değişiminin etkisini incelemek amacıyla değişik sıcaklıklarda ve değişik zaman aralıklarında kullanılan enzim çözeltilerinin aktiflikleri tayin edilmiştir. Serbest PPO enziminin 45
0C 40 dakikada inkübe edildiğinde aktifliğini kaybettiği gözlenmiştir.
0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 zaman(dakika) Ba ğ ıl A kti vi te % serbest Ca-aljinat Ba-aljinat aljinatlı polimer aljinatsız polimer
Şekil 3.19. Serbest ve immobilize PPO’nun maksimum aktifliğini zamanla değişimi
3.5. Serbest ve Poliakrilamid Kullanılarak İmmobilize Edilen PPO Enziminin Oda Koşullarında Aktifliğine Depolanma Süresinin Etkisi
Serbest, aljinat poliakrilamid, poliakrilamid, Ca-aljinat ve Ba-aljinat kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin aktifliğine depolanma süresinin etkisini incelemek için çözeltiler oda koşullarında saklandı. Serbest enzim 4 saat sonra aktifliğini kaybederken, aljinat poliakrilamid 6 saat, poliakrilamid kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin aktifliğini 8 saat sonra tamamen kaybettiği gözlemlenmiştir. Ca-aljinat ile immobilize edilen enzim 30 günün sonunda %64 Ba-aljinat ise %58 oranında aktifliğini koruduğu görülmüştür.
0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 zaman(saat) Ba ğ ıl Akti vi te (% ) aljinat-poliakrilamit poliakrilamit serbest
Şekil .3.20 Oda koşullarında serbset, aljinat poliakrilamid, poliakrilamid kullanılarak 4-metil katekol substratına karşı PPO enziminin gösterdiği depolanma kararlılığı
0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 zaman(gün) Ba ğ ıl Akti vi te(% ) serbest Ca-aljinat Ba-aljinat
Şekil 3.21.Oda koşullarında serbset, Ca-aljinat, Ba-aljinat kullanılarak 4-metil katekol substratına karşı PPO enziminin gösterdiği depolanma kararlılığı
3.6. Serbest ve Poliakrilamid, Ca-aljinat Poliakrilamit ,Ca-aljinat ve Ba-aljinat Kullanılarak İmmobilize Edilen PPO Enziminin 4oC Koşullarında Aktifliğine Depolanma Kararlılığı
Serbest, poliakrilamid, aljinat poliakrilamit, Ca-aljinat ve Ba-aljinat kullanılarak immobilize edilen PPO enzimi 4 OC’de depolanarak her gün aktivitesi takip edilmiştir. 30 günün sonunda; serbest enzim aktifliğini % 42 korurken, Ca-aljinatlı %81, Ba-aljinatlı %83, aljinatlı polimer %60, aljinatsız polimer %64 oranında aktifliğini koruduğu gözlemlenmiştir.
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 zaman(gün) Ba ğ ıl a kti vi te (% ) serbest Ca-aljinat Ba-aljinat aljinatlı polimer aljinatsız polimer
Şekil 3.22. Serrbest ve Poliakrilamid, Ca-aljinat Poliakrilamit, Ca-aljinat ve Ba-aljinat Kullanılarak İmmobilize Edilen PPO Enziminin 4 oC Koşullarında Aktifliğine Depolanma Kararlılığı
3.7. Ca-aljinat, Ba-aljinat, Aljinatlı Polimer ve Aljinatsız Polimer ile İmmobilize Edilen Enzimin Tekrar Kullanılabilirliği
Ca-aljinat ve Ba-aljinat, aljinatlı poliakrilamit, poliakrilamit kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin tekrar kullanım sayısını incelemek amacı aktiflikleri tayin edildi. Ca-aljinat için 3 kez kullanım sonunda %95, 7 kez kullanım sonunda %81, 12 kez kullanım sonunda ise yaklaşık %26, aktiflik gösterirken; Ba-aljinat için 3 kez kullanım sonunda %100, 7 kez kullanım sonunda %75, 12 kez kullanımın sonunda ise %24, aktiflik gösterdiği bulundu.
Aljinatlı poliakrilamit için 3 kez kullanım sonunda %87, 10 kez kullanım sonunda %30, aktiflik gösterdiği, poliakrilamit için ise 3 kez kullanım sonunda %97, 9 kez kullanım sonunda %36, aktiflik gösterdiği bulunmuştur.
Şekil 3.23. Ca-aljinat, Ba-aljinat, aljinat poliakrilamit, poliakrilamit kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin tekrar kullanım sayısı
BÖLÜM 4. SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ
Rokadan (Eruca vesicaria) PPO enzimi uygun şartlarda izole edilerek kinetik olarak optimum pH, sıcaklık ve substrat spesifikliği belirlenerek karakterize edilmiştir. Substratlardan 4-metilkatekol, pyrogallol, gallik asit, L-tirozin için optimum pH’ları 5,0 katekol için ise 4,5 olarak bulunmuştur. Yine.4-metil katekol pyrogallol, gallik asit, L-tirozin için enzimin optimum sıcaklığı 20 0C katekol için 30 0C olarak bulunmuştur. Km değeri ise 4-metil katekol, katekol, pyrogallol, gallik asit, L-tirozin için sırasıyla 3,68, 5,36, 4,66, 8,92, 8,68 mM olarak bulunmuştur.
Endüstride PPO enziminin daha uzun ömürlü ve kararlı olması için çeşitli yöntemlerle farklı kaynaklardan elde edilen PPO enzimi immobilize edilmiştir. Bu çalışmada roka (Eruca vesicaria) bitkisinden karakterize edilen PPO enzimi Ca-aljinat, Ba-Ca-aljinat, poliakrilamit ve poliakrilamit-aljinat kullanılarak hapsetme yöntemi ile başarıyla immobilize edilmiştir.
Serbest PPO ve dört farklı şekilde immobilize edilen PPO enziminin optimum pH değeri 5.0 olarak bulunurken, optimum sıcaklık değerleri serbest, Ba-aljinat ve polimerize edilmiş PPO için 200C iken Ca-aljinat ile immobilize edilmiş enzimin optimum sıcaklık değeri 30 °C olarak bulundu.
+4 0C de Serbest enzim, Ca-aljinat, Ba-aljinat, aljinatlı poliakrilamit ve poliakrilamit ile immobilize edilen PPO enzim depolandığında 30 gün sonunda serbest enzimin aktifliğinin %42 oranında, Ca-aljinat ve Ba-aljinatla immobilize PPO enzimin aktifliğini % 81 ve % 83 oranında, aljinatlı poliakrilamit ve poliakrilamit ile immobilize edilen PPO enzimin ise %60 ve %64 oranında aktifliğini koruduğu gözlemlenmiştir.
Oda koşullarında Serbest enzim, Ca-aljinat, Ba-aljinat, aljinatlı poliakrilamit ve poliakrilamit ile immobilize edilen PPO enzimi depolandığında 30 gün sonunda; serbest enzim aktifliğini % 42 korurken, Ca-aljinatlı %64, Ba-aljinatlı %58 oranında aktifliklerini korudukları gözlemlenmiştir. Aljinatlı polimer ve aljinatsız polimerile imobilize edilen enzim ise gün içinde Aljinatlı polimer 6 saat sonunda, aljinatsız polimer ise 8 saat sonra aktivitelerini kaybettiği gözlemlenmiştir.
Serbest enzim Ca-aljinatlı ve polimerize edilmiş enzim 45 0C de 40 dakika inkübe edildiğinde aktivitelerini yitirdikleri gözlemlendi.
Tekrar kullanım ölçümünde Ca-aljinatl, Ba-aljinat ve poliakrilamit ve aljinat poliakrilamit ile immobilize edilen PPO enziminin Ca-aljinat ve Ba-aljinat, aljinatlı poliakrilamit, poliakrilamit kullanılarak immobilize edilen PPO enziminin, Ca-aljinat için 3 kez kullanım sonunda %95,7 kez kullanım sonunda %81, 12 kez kullanım sonunda ise yaklaşık %26, aktiflik gösterirken; Ba-aljinat için 3 kez kullanım sonunda %100, 7 kez kullanım sonunda %75,12 kez kullanımın sonunda ise %24, aktiflik gösterdiği bulundu. Aljinatlı poliakrilamit için 3 kez kullanım sonunda %87,10 kez kullanım sonunda %30, aktiflik gösterdiği, poliakrilamit için ise 3 kez kullanım sonunda %97, 9 kez kullanım sonunda %36, aktiflik gösterdiği gözlemlenmiştir.
Böylece PPO enzimi ilk defa roka bitkisinden izole edilerek Ca-aljinat, Ba-aljinat, poliakrilamit ve aljinat-poliakrilamit kullanılarak hapsetme yöntemi ile ilk defa immobilize edilerek karakterize edilmiştir. Çalışmalarımızın endüstriyel kullanım amaçlı olarak immobilize enzim uygulamalarına yeni bir kaynak sağlandığı düşünülmektedir.
KAYNAKLAR
[1] ÖNEZ, Z., " Üzümden (vitis vinifera l.) izole edilen polifenol oksidaz enziminin özelliklerinin belirlenmesi", Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara 2006.
[2] ZİYAN, E., "Polifenol oksidaz enziminin Ankara armudu (pyrus communis)’ndan izole edilmesi, saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi" ,Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Ankara, 1998.
[3] YENSON, M., "İnsan biyokimyası", İstanbul Üniversitesi Tıp Anabilim dali, Kırklareli, 1984.
[4] PAMUK, F., "Biyokimya", Gazi Kitapevi, Ankara, 2000.
[5] ÖZATA, A., KUTLU, M., "Enzimoloji ders notları" T.C. Anadolu Üniversitesi Yayınları No:1254, Fen Fakültesi Yayınları No:15, Eskişehir,2000.
[6] ERDEN İNAL., M. " Biyokimya", T.C. Anadolu Üniversitesi Yayınları No:489, Açıköğretim Fakültesi Yayınları No: 218,Eskişehir, Eylül, 1996. [7] www.mustafaaltinisik.org.uk, (5.5.2010)
[8] ÖZTAN, D., "Tirosinaz enziminin ekstraksiyonu saflaştırılması ve fenollerin giderilmesinde kullanılması", Yüksak Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, Temmuz, 2007.
[9] SAÇAK. M., "Kimyasal kinetik" Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü, Gazi Kitapevi, Ankara, 2002.
[10] URUÇ, H., " Katalaz enziminin (E.C.1.11.1.6) montmorillonit analsim kili üzerine immobilizasyonu ve kinetiğinin incelenmesi", Yüksek Lisans Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Van, 2007.
[11] ERKAYA., E. ÇAYLIKOCA, B, A., KALİNYAPRAK, F., "Enzimatik kataliz" Selçuk Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü, Konya, 2006.
[12] MARANGONI., A, G. "Enzyme kinetics a modern approach", Department of Food Science University of Guelph, 2003.
[13] BAO, HAİHONG., "Biocatalysis of tyrosinase in organic solvent media using phenolic substrate models" A Thesis submitted to the Faculty of Graduate Studies and Research in partial fulfillment of the requirements of the degree of Master of Science, Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University Montreal, Quebec, Canada, Mayıs, 1999.
[14] KIRALP, S., " Synthesis of conducting block copolymers and their use in the immobilization of invertase and polyphenol oxidase enzyme", A thesis submıtted to the graduate school of natural and applied sciences of the middle east technical unıversity, in partial fulfıllment of the requırements for the degree of doctor of philosophy in the department of chemistry, Mayıs, 2004.
[15] CRUMİERE, F., " Inhibition of enzymatic ,browning in food products using bio-ingredient", A thesis submitted to the Faculty of Graduate Studies and Research in partial fullilIment of the tequiremcois of the degree of Master of Science, Department of Food Science and Agricoltural Cbernistry McGill University Montreal, Québec, Eylül, 2000.
[16] ASTARCI, E., "Production and biochemical characterization of polyphenol oxidase from thermomyces lanugınosus", A thesis submitted to the graduate school of natural and applied sciences of the middle east technical university, in partial fulfillment of the requırements for the degree of master of science in the department of biotechnology, Haziran, 2003.
[17] DEMİR, Ö., " Muşmula (mespilus germanica l.) meyvelerinin olgunlaşması sırasındaki polifenol oksidazın karakterizasyonu" ,Yüksek Lisans Tezi, Karadeniz Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Trabzon, Ağustos, 2006.
[18] MADANİ, W., "Characterization of a polyphenol esterase from aspergillus niher and ıts role in the Inhibition of tyrosinase", a thesis submitted to the faculty of graduate studies and research in partial fulfillment of the requuemenb of the degree of doctor of philosophy, Department of Food Science & Agricultural Cbemistry McGiIl University Montreal, Canada, Mayıs, 2000.
[19] MARSHALL, M, R.., KİM, J., WEİ.,C-I., " Enzymatic browning in fruits, Vegetables and Seafoods", 2000.
[20] JUKANTİ, A, K., " Molecular and biochemical characterization of wheat (triticum aestivum. l) polyphenol oxidases (ppos)", A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Plant Sciences, Montana State Unıversity Bozeman, Montana, Ocak, 2005.
[21] SAĞIROĞLU, A., YAĞAR, H., " Partially purifcation and characterization of polyphenol oxidase of quince" Turk J Chem, 26 (2002), 97 -103., Edirne, 2000.
[22] DOĞAN, M., DOĞAN, S., " Determination of kinetic properties of polyphenol oxidase from thymus (thymus longicaulis subsp. chaubardii var. chaubardii)" Food Chemistry 88 (2004) 69–77, Balıkesir, 2003.
[23] CEMEROĞLU, B., YEMENİCİOĞLU, A., " Hale haven şeftalilerinde polifenol oksidaz enzimlerinin bazı nitelikleri" Tr. J. of Agriculture and Forestry, 22 (1998) 261–265, Ankara, 1996.
[25] KUFREVİOGLU, İ., ŞAKİROĞLU, H., ERAT, M., "Purification and characterization of polyphenol oxidase from Ferula sp.", Food Chemistry 95 (2006) 503–508, Erzurum, 2005.
[26] ARSLAN, O., ERZENGİN, M., SİNAN, S., ÖZENSOY, Ö., "Purification of mulberry (Morus alba L) polyphenol oxidase by affinity chromatography and investigation of its kinetic and electrophoretic properties", Food Chemistry, Balıkesir , 2004.
[27] PEKYARDIMCI,Ş. ZİYAN, E., "Characterization of Polyphenol Oxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus)", Turk J Chem, 27 (2003) , 217 .225., Ankara, 2001.
[28] www.food-info.net/, (12.5.2010)
[29] ÖZEN, A., COLAK, A., DİNÇER, B., GÜNER, S., AYAZ, A., " Diphenolases from two cultivars of cherry laurel (Laurocerasus officinalis Roem.) fruits at an early stage of maturation", Food Chemistry 90 (2005) 801–807, Trabzon.
[30] ÜNAL, M. Ü., " Properties of polyphenol oxidase from Anamur banana (Musa cavendishii)" Food Chemistry 100 (2007) 909–913, Adana, 2005. [31] AYDEMİR, T., KAVRAYAN, D., ÇINAR, S., "Isolation and
characterisation of polyphenoloxidase from jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus)", S.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Fen Dergisi, Sayı 21 (2003) 115-125, Konya.
[32] ÖZÇELİK, D., "Mantardan (agaricus bisporus) tirozinaz enziminin izole edilmesi ve fenol giderilmesinde kullanılması", Yüksek Lisans Tezi, GAZİ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Ankara, 2005.
[33] http://www.forumacil.com/sifali-bitkiler-sozlugu/195184-rokanin-sagliga-yararlari-rokanin-faydasi-nedir-roka-nelere-iyi-gelir.html ( 2.7.2010)
[35] YAHŞ, A., “Aljinat jel boncukları ve poli(akrilamit-ko-akrilik asit) hidrojellerle tirosinaz enziminin binari yöntemi ile immobilizasyonu”, Yüksek Lisans Tezi GAZİ Üniversitesi Ankara 2005.
[36] KÖKLÜKAYA, S., “Poli(akrilamit-krotonik asit)/sodyum aljinat, poli(akrilamit-krotonik asit)/K-karragenan, poli(akrilamit-sitrakonik asit)/K-karragenan hidrojellerinde lakkaz immobilizasyonu”, Yüksek Lisans Tezi, GAZİ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Ankara 2008.
[37] KARACA, K., “Poli(N,N-dimetil akrilamit-ko-akrilamit) poli(N-izopropilakrilamit-ko-akrilamit)/k-karragenan polimerleri kullanılarak lipaz enziminin immobilizasyonu”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Ankara 2006.
[38] GÖKÖZ, M., “lakkazın poliakrilamit ve poliakrilamit K-karragenan jellerine immobilizasyonu”, Yüksek Lisans Tezi, KIRIKKALE Üniversitesi 2006.
[39] TUNÇ, G., ”Poli(metilmetakrilat-ko-glisidilmetakrilat) hidrojeli kullanılarak B-galaktosidazın kovalent bağlanma ile immobilizasyonu” Yüksek Lisans Tezi GAZİ Üniversitesi Ankara 2006.
[40] http://www.turkcebilgi.com/roka/ansiklopedi
http://www.gozdekadinlar.com/roka-hakkinda-kucuk-bir-tuyo.html http://www.hakkinda-bilgi-nedir.com/sifali-bitkiler-roka-faydalari-nedir+sifali-bitkiler-roka-faydalari-hakkinda-bilgi(16.6.2010)
ÖZGEÇMİŞ
Hüseyin KÖSE, 08.01.1984’de Adapazarı’nda doğdu. İlk ve ortaöğretimini Sakarya’nın Kaynarca ilçesinde tamamladı. 2001 yılında Erzurum Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünü kazandı. 2005 yılında aynı fakültenin kimya bölümünden kimyager olarak mezun oldu. 2007 yılında ise Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans öğrenimine başladı.