Hisse Senedi Fiyatları Kanalı

No presente trabalho foram utilizados túbulos de Malpighi de indivíduos do gênero Myrmeleon (Neuroptera, Myrmeleontidae).

As larvas de Myrmeleon sp foram coletadas em Barra do Monjolo (MG), (20°15’50.58’’S e 49°13’18.39’’W), às margens do Rio Grande e, também, na Fazenda

Experimental de Pindorama (SP) (21°13’16.89’’S e 48°54’31.65’’W). Em ambas as localidades ocorre a presença de uma mata nativa e solo arenoso. A terra do local onde havia a cova da larva de formiga-leão foi retirada com o auxílio de uma colher e passada por uma peneira de malha fina. As larvas coletadas foram guardadas individualmente, em tubos de ensaio fechados com um chumaço de algodão. Foram coletadas larvas de diferentes fases de desenvolvimento, tomando como base o diâmetro das armadilhas que essas larvas produzem para capturar pequenos artrópodes para sua alimentação.

No laboratório, as larvas foram colocadas individualmente em frascos de vidro de volume aproximado de 200 mL, contendo areia, previamente peneirada, em até 1/3 do seu volume. A alimentação das larvas no laboratório foi feita fornecendo-se moscas do gênero Drosophila, levemente imobilizadas com éter, colocadas diretamente sobre a armadilha de cada larva.

Estadios e Órgãos Analisados

Os espécimes coletados foram separados em lotes, de acordo com o tamanho larval medido com a ocular milimétrica: larvas L1 (com dimensões de até 2,3 mm),

larvas L2 (com dimensões de 2,4 até 4,6 mm), larvas L3 (com dimensões acima de 4,6 mm) e indivíduos adultos.

Análise Ultraestrutural

Os túbulos de Malpighi foram extraídos das larvas e dos indivíduos adultos e fixados em Karnovsky, durante 24 horas. Após a fixação, o material foi mergulhado em tetróxido de ósmio 1% (3:1), por 2 horas. Decorrido esse tempo os túbulos foram retirados da solução de ósmio e lavados com água destilada por 5 minutos. Os túbulos de Malpighi foram, então, desidratados numa série crescente de acetonas: 30% (15 minutos); 50% (15 minutos); 70% (15 minutos); 90% (15 minutos); 95% (45 minutos) e 100% (45 minutos). Após a desidratação, o material foi pré-infiltrado numa solução de Araldite pura e Acetona 100% (1:1), permanecendo em frasco fechado durante 16 horas. Em seguida à pré-infiltração, procedeu-se a infiltração com Araldite pura.

Os cortes ultrafinos foram realizados ao ultramicrótomo (Leica Ultracut UCT), com cerca de 5µm de espessura. Os cortes foram contrastados em acetato de uranila 2%, por 12 minutos (Watson, 1958), e pelo citrato de chumbo 2%, em solução de hidróxido de sódio, por 10 minutos (Venable e Coggeshall, 1965). A análise ultraestrutural foi realizada ao Microscópio de Transmissão ZEISS EM 910, operado a 80 kV.

3. RESULTADOS

Em Myrmeleon sp (Neuroptera, Myrmeleontidae) foram observados oito túbulos de Malpighi ligados ao epitélio que envolve o intestino médio (Pacheco, 2001). Seis dos túbulos são criptonéfricos e se ligam na região posterior do intestino, os outros dois encontram-se livres na cavidade abdominal. Em continuidade ao intestino encontra-se o tubo retal que termina em uma estrutura em forma de funil, aparentemente livre na cavidade abdominal (Pacheco, 2001).

Os túbulos podem ser diferenciados em três regiões distintas, um segmento proximal de menor calibre e cor mais clara, um segmento intermediário, de maior calibre e um segmento distal, onde o diâmetro do túbulo volta a se estreitar. Nos adultos os túbulos apresentam-se com uma aparência bem diferente, mostrando-se intensamente ondulados em toda a sua extensão, sem distinção das três regiões (Pacheco, 2001).

Uma das regiões do túbulo, região proximal, é composta por células, cujos núcleos encontram-se bastante compactados e o citoplasma é rico em vesículas de secreção. Na outra região do túbulo de Malpighi, região média, ou intermediária, a cromatina dos núcleos encontra-se altamente descompactada, sugerindo que a atividade de transcrição é alta, e também é observada a presença de inúmeras vesículas de secreção. Na região distal as células apresentam abundância de concreções citoplasmáticas. Os resultados das análises ultraestruturais são apresentados a seguir:

Numa observação geral dos cortes dos túbulos de Malpighi, nota-se a presença de várias gotículas, por toda a extensão do túbulo, e a presença de microvilosidades no lúmen que, nesta fase, apresentam-se em pequeno número (Figura 1A). O citoplasma apresenta um pequeno número de mitocôndrias, caracterizadas como “gancho de

telefone” (Figura 1B). Também pode ser observada, no citoplasma destas células, a

presença de gotas, provavelmente de material gorduroso, que se encontra em grande quantidade e em diferentes tamanhos. Muitas destas gotas se apresentam ligadas a depósitos de glicosaminoglicanas (Figura 1B e Figura 1E).

Os núcleos das células presentes nesta região do túbulo apresentaram algumas características, como cromatina bastante compactada, sendo que esses blocos condensados podem ser vistos ocupando diferentes regiões do núcleo. Nesta fase podem ser observados até dois nucléolos presentes em cada núcleo (Figura 1C).

Em observação mais acurada foram notadas junções septadas ligando as células que compõem a parede do túbulo (Figura 1D). As células do epitélio do túbulo apresentam grandes vacúolos claros (Figura 1E), estes vacúolos muitas vezes encontram-se rodeados por um halo elétron-denso (Figura 1F), típicos de concreções citoplasmáticas.

Larvas L2

Na fase larval L2 pode-se notar nitidamente que os depósitos de glicogênio, são mais abundantes que na fase anterior, e estão associados às gotículas de gordura (Figura 2A), que ficam localizadas ao redor destes depósitos. O lúmen dos túbulos de Malpighi caracteriza-se por uma grande abertura, bastante irregular e já apresentando uma maior

quantidade de microvilosidades, que parecem estar impregnadas com produtos de secreção. Observa-se também a presença de inúmeras extensões da membrana basal junto à parede do túbulo de Malpighi (Figura 2B).

O estudo destas células indicou a presença de núcleos distintos. Alguns dos núcleos analisados apresentaram a cromatina mais descompactada, com regiões heterocromáticas, localizadas preferencialmente, na periferia nuclear ou associados ao nucléolo. A figura 2C mostra um detalhe de corte transversal de túbulo de Malpighi com a presença de dois núcleos, em pólos opostos do túbulo. Na região basal da célula observa-se a presença de uma grande quantidade de mitocôndrias. O citoplasma dessas células possui vesículas de secreção de diferentes tamanhos e as microvilosidades, presentes no lúmen do túbulo, encontram-se repletas de material a ser secretado por essas células (Figura 2D). Em algumas células notamos que estas vesículas secretoras encontram-se fusionadas com peroxissomos (Figura 2E). O nucléolo apresenta-se associado à heterocromatina, que forma alças ao seu redor (Figura 2F). Próximo ao núcleo, encontramos inúmeras gotículas lipídicas com diferentes tamanhos (Figura 2G).

Também ficou evidente a presença de outro tipo de célula, cujos citoplasmas estavam totalmente preenchidos por concreções citoplasmáticas, resultantes do metabolismo do ácido úrico. Nesses túbulos o lúmen apresentou os contornos mais irregulares e as microvilosidades apareceram em menor número e apresentaram um

aspecto de ‘desorganização’ (Figura 3A). No citoplasma destas células quase não

observamos organelas, mas foi notada a presença de aglomerados de mitocôndrias (Figura 3B) com maior tamanho. Além do grande número de concreções citoplasmáticas, ficam também evidentes as invaginações das membranas basais (Figura 3C).

Larvas L3

Nessa fase as diferenças foram mais evidentes entre as populações de células, permitindo observar dois tipos celulares distintos. Um dos tipos celulares apresenta vesículas claras, grandes, contendo produto de secreção (Figura 4A), que muitas vezes está presente entre as microvilosidades dessas células, sendo exportadas para o lúmen do túbulo (Figura 4B). O lúmen destes segmentos dos túbulos de Malpighi é maior que o das outras regiões e apresenta uma quantidade menor de microvilosidades, que

parecem estar ‘desorganizadas’.

A cromatina do núcleo destas células apresentou-se extremamente descompactada, com regiões heterocromáticas distribuídas por todo o núcleo. Em algumas células observou-se a presença de dois grandes nucléolos. Os núcleos são multilobulares, sugerindo que o aumento de DNA levou a uma extensão do citoplasma destas células (Figura 4C). Nesse tipo celular o citoplasma apresenta-se repleto de gotas de secreção, que se encontram associadas aos grânulos de glicogênio. Ocorre uma maior quantidade de retículo endoplasmático nessas células (Figura 4D).

Em outro grupo de células, a característica mais evidente é o citoplasma, que se encontra totalmente preenchido por concreções citoplasmáticas. As concreções apresentam diferentes tamanhos e características: as maiores mostram um grande número de alos em seu interior e outras apresentam o centro elétron-denso (Figura 4E).

Adultos

As células dos túbulos de Malpighi da fase adulta apresentam número reduzido de concreções citoplasmáticas. As gotículas de secreção, que estavam presentes em

grande quantidade na fase anterior (L3), são pouco observadas, sendo grandes e claras. Nestas células a característica mais evidente é o grande número de invaginações da membrana plasmática na região basal (Figura 5A). Algumas mitocôndrias podem ser

observadas no citoplasma, sendo caracterizadas pela forma de “gancho de telefone”. O

lúmen dos túbulos de Malpighi dos indivíduos adultos parece apresentar também uma redução na quantidade de microvilosidades, assim como uma desorganização (Figura 5B).

Figura 1A–B: Aspectos ultraestruturais dos túbulos de Malpighi de larvas L1. A. Secção transversal do túbulo de Malpighi mostrando gotículas por toda a sua extensão.

B e C. Núcleo com blocos de cromatina condensada. D. Detalhe de junção septada. E.

Corte transversal do túbulo mostrando núcleo com cromatina condensada. F. Detalhe de duas vesículas de secreção. Mi=mitocôndrias; N=núcleo; JS=junção septada;

A

B

C

D

E

F

G

C

V

P

P

Figura 2A-G: Ultraestrutura dos túbulos de Malpighi de larvas L2. A. Vesículas de

secreção ligadas a grânulos de glicogênio. B. Visão geral de um túbulo com grande quantidade de microvilosidades e vesículas no citoplasma das células. C. Detalhe de túbulo com dois núcleos. D. Região do túbulo apresentando várias vesículas. Notar o lúmen do túbulo repleto de secreções. E. Citoplasma mostrando fusão de peroxissomo com a vesícula. F. Núcleo apresentando heterocromatina associada ao nucléolo (setas).

G. Citoplasma com inúmeras gotículas lipídicas (seta). N=núcleo; P=peroxissomo; V=vesícula. Aumentos: A=27.800X; B=21.560X; C=4.646X; D=16.700X; E=16.700X; F=12.930X; G=10.000X.

Figura 3A-C: Aspectos ultraestruturais dos túbulos de Malpighi de larvas L2. A. Túbulo com grande quantidade de concreções citoplasmáticas. B. Região do citoplasma contendo muitas mitocôndrias. C. Região do citoplasma rica em concreções citoplasmáticas. Mi=mitocôndria; C=concreção. Aumentos: A=4.646X; B=16.700X;

Figura 4A–E: Aspectos ultraestruturais do túbulo de Malpighi de larvas L3. A. Presença de uma grande vesícula de secreção. B. Célula com grande número de microvilosidades. Notar as gotículas de secreção entre as vilosidades. C. Núcleo multilobulado com cromatina descompactada e heterocromatina associada a dois nucléolos. D. Célula apresentando o citoplasma repleto de vesículas de secreção associadas a grânulos de glicogênio. E. Região do citoplasma com concreções citoplasmáticas. VS=vesícula de secreção; C=concreções; N=núcleo; Nu=nucléolo;

L=luz do túbulo; M=microvilosidades. Aumentos: A=21.560X; B=27.800X; C=6.000X D=7.750X; E=21.560X.

Figura 5A-B: Aspectos ultraestruturais de túbulo de Malpighi de indivíduo adulto. A.

Região do túbulo com grande quantidade de extensões citoplasmáticas próximas à membrana basal. B. Detalhe do túbulo de adulto com grande número de microvilosidades. I=invaginações da membrana plasmática; M=microvilosidades. Aumentos: A=12.930X; B=27.800X.

4. DISCUSSÃO

Das informações obtidas, com base nas análises ultraestruturais das células dos túbulos de Malpighi, em várias fases do desenvolvimento de Myrmeleon sp, podemos confirmar a presença de três diferentes regiões dos túbulos que, por sua vez, são compostas por duas populações celulares. Esses tipos celulares são diferenciados, principalmente, pela presença de duas estruturas intracitoplasmáticas: vesículas de secreção e concreções citoplasmáticas.

A maioria das concreções origina-se em células onde elas encontram-se separadas por uma membrana originada do citoplasma ao redor (Bradley, 1985). As concreções podem ser diferenciadas dependendo dos componentes que estas apresentem, sendo a maioria das concreções compostas dos seguintes elementos: bicarbonato, cálcio, proteoglicanas, fosfatos e magnésio. Em Drosophila concreções denominadas tipo I são encontradas nos segmentos distais dos túbulos de Malpighi anterior, sendo que estas concreções são encontradas somente em células principais, não em células estreladas (Wessing e Zierold, 1999).

O ácido úrico é outro composto nitrogenado da hemolinfa e sua eliminação não está associada à perda de água, quando presente em grande quantidade, ele é filtrado pelos túbulos de Malpighi e acumulado ao longo destes, principalmente na porção distal, na forma de cristais (O’Donnell et al., 1983).

Possivelmente, essas células tenham a função de osmorregulação, ou seja, a produção da urina primária e de excreção de resíduos e compostos tóxicos, que são essenciais para as funções básicas em todos os insetos. Em células de túbulos de Malpighi de Myrmeleon sp, o tipo celular que se apresenta totalmente preenchido por

JS

JS

concreções deve ser aquele no qual as células encontram-se localizadas na região distal. Nesta localidade, o tamanho celular permanece o mesmo, não havendo uma mudança no tamanho e na forma nuclear, portanto essas células devem permanecer com a sua função primária de promover a remoção da hemolinfa de resíduos nitrogenados e, desta forma, como resultado, encontramos metabólitos resultantes da via de produção da urina, que são as concreções citoplasmáticas. Segundo Donini et al (2008) os cristais são formados por sais filtrados e acumulados da hemolinfa. Em Dione juno juno (Lepidoptera: Nymphalidae), a principal substância filtrada da hemolinfa é o ácido úrico, que entra no lúmen dos túbulos na porção anterior e é carregado por toda a extensão até a porção distal, onde ocorre a reabsorção da água e os cristais de ácido úrico precipitam (Cardoso

et al., EPCC, 2009).

A associação das células epiteliais da região distal dos túbulos de Malpighi com o epitélio do intestino posterior forma uma região que, provavelmente, está envolvida na reabsorção de fluidos.

Na outra população celular não se observou a presença das concreções citoplasmáticas. Esta população celular encontra-se na região anterior e média dos túbulos de Malpighi. A principal característica destas células foi a presença no citoplasma de inúmeras vesículas de secreção. Uma maior descompactação nuclear é observada na última fase larval, sugerindo que as proteínas produzidas estejam relacionadas à formação dos fios do casulo de pupação (Pacheco, 2002). Nestas regiões dos túbulos, os núcleos das células apresentaram um maior número de nucléolos, característica que também reforça a alta atividade de transcrição. Dessa forma, pode ser inferido, que a função primordial dessas células seja a síntese de proteínas dos fios de seda para formar o casulo de pupação do inseto, que é realizada por regiões específicas dos túbulos de Malpighi. Nos túbulos de Malpighi de Mymerleon sp temos a presença

de três regiões distintas que são caracterizadas pelos tipos celulares encontrados. Na região anterior temos células que, provavelmente, permanecem com a sua estrutura nuclear pouco modificada, mas que apresenta em sua constituição um aumento com o decorrer das fases das vesículas de secreção, que durante o desenvolvimento larval vai mudando a morfologia nuclear e aumentando o número de vesículas. Na região distal do túbulo onde ocorre a reabsorção da água pelo sistema criptonefridial, tem-se a formação das concreções que estão relacionadas com as funções de regulação osmótica pelo inseto e, na fase adulta, há uma acentuada diminuição das vesículas de secreção, já que o inseto encontra-se com outras atividades fisiológicas, não mais necessitando da produção de seda para formação do casulo.

A fase larval de Myrmeleon sp é encontrada em ambientes secos, assim é possível que os segmentos distais dos túbulos de Malpighi deste inseto estejam envolvidos na retirada de água e íons das fezes, como ficou sugerido pela presença de numerosas concreções citoplasmáticas. Na região mediana do túbulo não encontramos essa quantidade de concreções, mas sim a presença de inúmeras vesículas secretoras, o que está relacionado com a produção de seda pelo inseto. Os resultados do presente estudo sobre as funções de osmorregulação e produção de proteínas da seda pelos diferentes segmentos dos túbulos de Malpighi de Myrmeleon sp demonstram que este sistema excretório em insetos têm evoluído de forma semelhante em outros grupos, indicando a adaptação fisiológica destes organismos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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