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A estrutura da cromatina sofre modificações profundas durante o desenvolvimento pré-implantação, e sua arquitetura global reflete o comprometimento com a pluripotência e a diferenciação de linhagens em embriões de camundongos (AHMED et al., 2010). Os autores demonstraram que núcleos de blastômeros de

embriões de 2 células apresentam pequenos blocos de cromatina no envelope nuclear e na periferia do corpo precursor nucleolar, e já em 4 células, os blastômeros apresentam cromatina mais compacta no envelope nuclear e grandes blocos de cromatina compacta. Durante a transição entre embriões de 4 e 8 células, a cromatina se torna altamente dispersa, com apenas alguns domínios compactos; esta configuração é mantida em embriões de 16 células. Após a diferenciação de linhagens, no blastocisto 3.5 dias após a fertilização (E3.5), a diferença entre o perfil cromatínico dos núcleos se torna evidente: células do epiblasto apresentam cromatina altamente dispersa, enquanto células do trofectoderma apresentam clusters de cromatina compacta e pouca cromatina dispersa, e em células do endoderma primitivo blocos de cromatina compacta e poucas fibras de 10nm dispersas são descritos. Desta forma, fica claro existir uma diferença entre a organização de cromatina na segregação de linhagens do blastocisto, sendo as linhagens diferenciadas identificáveis pela configuração mais compacta da cromatina.

Dentre os principais componentes da cromatina, que desempenham funções cruciais na regulação da transcrição gênica, estão as modificações pós-traducionais de histonas (BANNISTER & KOUZARIDES, 2011). A metilação (me) de histonas representa uma poderosa forma de regulação das funções do DNA, incluindo processos fundamentais como a transcrição gênica e o reparo. A metilação de histonas pode ocorrer tanto em resíduos lisinas (K) quanto em argininas (R), e sua função depende do resíduo que é modificado. Acredita-se que a metilação induz a alterações na cromatina que tanto relaxam quanto compactam sua estrutura, e por se tratar de um grupamento pequeno, suas funções provavelmente são ocasionadas mais pela criação de sítios de ligação de outros reguladores, do que por alteração de carga ou conformação (BANNISTER & KOUZARIDES, 2005).

O padrão de distribuição das modificações de histonas sofre também alterações durante a embriogênese. O desenvolvimento do blastocisto, em que duas linhagens principais (MCI e TE) são formadas, é acompanhado por uma distribuição assimétrica da marca repressiva H3K27me3 em promotores de genes regulados ao longo do desenvolvimento, como Oct4 (enriquecido em células do TE e reduzido em células da

MCI) e Cdx2 (enriquecido em células da MCI) (DAHL et al., 2010). Esta assimetria é também observada globalmente, por experimentos de imunofluorescência, nos quais se observa H3K27me3 elevada nas células da MCI (ERHARDT et al., 2003). Este fenômeno parece ser necessário para orientar a expressão de diversos genes, importantes tanto para a aquisição de pluripotência e sua manutenção, quanto para a diferenciação.

Portanto, apesar de frequentemente estarem presentes em diversas linhagens celulares, evidências demonstram que algumas modificações de histona são especialmente importantes para processos específicos. Outro exemplo interessante reside no processo de metilação de argininas. A enzima CARM1 é uma metiltransferase, que adiciona grupamentos metil a argininas da histona H3. Não está clara qual função a enzima desempenha sobre a regulação gênica, embora para o resíduo R17 a metilação pareça estar relacionada à ativação transcripcional (BANNISTER & KOUZARIDES, 2005; BANNISTER & KOUZARIDES, 2011).

Neste contexto, foi hipotetizado que a atividade de CARM1 poderia estar relacionada às diferenças observadas entre o potencial de desenvolvimento dos blastômeros de embriões de 4 células. Experimentos estudando os níveis de algumas modificações epigenéticas decorrentes da atividade de CARM1, como a metilação da arginina 17 e 26 da histona H3 (H3R17me e H3R26me), demonstram que as mesmas estão diminuídas em blastômeros que contribuirão para a formação do trofectoderma (blastômeros V), em embriões ME (TORRES-PADILLA et al., 2007). Este fato sugere que a atividade da enzima CARM1 seja mais elevada em blastômeros que contribuirão para o compartimento pluripotente dos embriões. Para confirmar esta hipótese, os autores manipularam, através da injeção de transcritos de RNAm de CARM1, os níveis da enzima em um dos blastômeros de embriões de 2 células, e perceberam que o aumento dos níveis de CARM1 determinava o aumento da expressão de Sox2 e Nanog em embriões de 8 células, assim como a maior contribuição destes blastômeros às células da MCI.

A enzima CARM1 foi também relacionada à pluripotência em células tronco embrionárias (WU et al., 2009). Sua expressão se mostrou necessária para a auto

renovação e pluripotência, uma vez que sua depleção diminuiu a expressão de genes pluripotentes levando as células à diferenciação. Os autores descreveram que CARM1 está associada com promotores dos genes Oct4 e Sox2, que apresentam elevados níveis de metilação de R17/26. Em células que são induzidas a expressar maiores níveis de CARM1, o promotor do gene Nanog também se associa com a enzima e apresenta metilação de argininas na histona H3; estas células apresentam altos níveis de expressão de Nanog, e atrasam sua resposta aos sinais para diferenciação.

Continuando a investigar os efeitos de CARM1 sobre a pluripotência, foi demonstrado que seus níveis influenciam a polaridade e destino de células nos embriões de camundongo (PARFITT & ZERNICKA-GOETZ, 2010). Por estudos de vídeos “time-lapse”, os autores observaram que os blastômeros induzidos a expressar maiores níveis de CARM1 sofriam divisões assimétricas, nas quais uma célula interna (e futuramente pluripotente) é originada, enquanto células expressando baixos níveis de CARM1 dividiam simetricamente e competiam por posições externas. Ainda, a expressão de proteínas polarizantes, como Par3, é reduzida em blastômeros expressando altos níveis de CARM1, enquanto Par1, EMK1 e PKCII (antagonista da proteína apical aPKC), relacionadas aos domínios basolaterais que não são enriquecidos em células que contribuirão ao TE, são elevados nos blastômeros induzidos a expressarem altos níveis de CARM1.

O modelo inicial proposto pelo grupo é, portanto, que as modificações epigenéticas responsáveis pela pluripotência afetariam a regulação da polarização e expressão gênica dos blastômeros, induzindo-os a fenótipo especifico (diferenciado ou pluripotente).

Em 2004, uma inédita forma de modificação de histonas foi descrita: a deiminação (CUTHBERT et al., 2004). Esta reação, denominada também citrulinização, consiste na modificação do resíduo de aminoácido arginina (R) em citrulina (C), pela substituição do grupamento químico NH2 por O (SLACK et al., 2011). A enzima responsável por promover esta reação no núcleo celular é denominada peptidil arginina deiminase 4 (PADI4). Na época, PADI4 emergiu como uma possível forma de regulação da metilação de argininas, uma vez que as citrulinas não podem ser metiladas por

CARM1 (CUTHBERT et al., 2004). Então, hipoteticamente, a deiminação impossibilitaria o estabelecimento da marca H3R26me, por exemplo. Ainda, estudos demonstraram que a substituição de resíduos de arginina já metilados seria também possível (WANG et al., 2004), ainda que se especule que possa haver outro agente envolvido que efetue a demetilação antes da PADI4 agir.

A citrulinização foi descrita a princípio como uma modificação repressiva de cromatina (WYSOCKA et al., 2006). No entanto, estudos recentes demonstram que a citrulinização está relacionada a formas descondensadas de cromatina, sugerindo que sua atividade seja de ativação de transcrição (WANG et al., 2009). Portanto, a forma como a citrulinização governa a estrutura de cromatina permanece por ser elucidada, mas é possível que haja diferente interferência dependendo de outros elementos presentes na regulação transcripcional.

Com a emergência de novas enzimas demetilantes antes desconhecidas, capazes de retirar grupamentos metil de histonas, ficou claro que a regulação da metilação de histonas pode ser independente da regulação de PADI4 (BANNISTER & KOUZARIDES, 2011). Porém, o mecanismo de transformação da arginina em citrulina pode consistir em uma forma de inibição da regulação realizada por CARM1, uma vez que PADI4 interage com CARM1 de certa forma. Ainda, outras formas de regulação da transcrição, independentes da enzima CARM1, também podem estar envolvidas no mecanismo de deiminação realizado por PADI4.

O objetivo deste estudo foi investigar se PADI4 participa da especificação das linhagens durante o desenvolvimento pré-implantacional. Para elucidar essa questão, avaliamos se PADI4 está presente e ativa em embriões, e se a manipulação da atividade da enzima poderia afetar o desenvolvimento normal. Aqui apresentamos resultados interessantes sugerindo que a atividade de PADI4 interfere com a diferenciação. A diminuição da atividade da enzima aumenta a especificação de células do trofectoderma, e o aumento da atividade de PADI4 tem o efeito contrário, diminuindo a diferenciação, e também aumentando os níveis de H3K27me3 - uma marca epigenética relacionada a células pluripotentes.

4.2 Material e Métodos