SDS-PAGE ve PAGE yöntemi ile enzimin molekül ağırlığı

SaflaĢtırma boyunca elde edilen fraksiyonlar toplanarak enzimin saflığının ve moleküler ağırlığının saptanması için Laemmli yöntemine (1970) göre PAGE (poliakrilamit jel elektroforezi) ve SDS–PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi) yöntemleri kullanılarak yapılmıĢtır. Standart olarak miyozin (205.000 Da), β-galaktozidaz (116.000 Da), fosforilaz B (97.400 Da), sığır albumini (66.000 Da), yumurta albumini (45.000 Da) ve karbonik anhidraz (29.000 Da) kullanılmıĢtır. Lipazın görüntülenmesi için PAGE ve SDS–PAGE kullanılarak zimogram yapılmıĢtır. SDS-PAGE, PAGE ve zimogram aĢağıda anlatıldığı gibi yapılmıĢtır.

Çözeltiler

% 30’luk akrilamid / N,N'- metilenbisakrilamid stok çözeltisi: 30 g akrilamid ve 0.8 g N,N'- metilenbisakrilamid 100 mL ultra saf suda çözülmüĢtür. Hazırlanan çözelti koyu renkli ĢiĢede ve + 4 °C’de saklanmıĢtır.

Ayırma tamponu (separating tamponu): 1,875 M Tris-baz hazırlandıktan sonra, konsantre HCl kullanılarak pH’sı 8.8’e ayarlanmıĢ ve oda sıcaklığında saklanmıĢtır.

YoğunlaĢtırma tamponu (Stacking tamponu): 0,6 M Tris-baz hazırlandıktan sonra konsantre HCl kullanılarak pH’sı 6.8’e ayarlanmıĢ ve oda sıcaklığında saklanmıĢtır.

Amonyum persülfat: % 10’luk amonyum persülfat ultra saf su içerisinde taze olarak hazırlanmıĢtır.

Sodyum dodesil sülfat (SDS): % 10’luk SDS ultra saf su içerisinde yavaĢ yavaĢ karıĢtırılarak hazırlanmıĢtır.

Örnek tamponu: 0,6 M Tris-baz (pH 6.8) 5 mL, SDS 0,5 g, sukroz 5 g, β-merkaptoetanolden 0,25 mL ve % 0,5’lik stok brom fenol mavisi çözeltisinden 5 mL alınarak karıĢtırılmıĢ ve hacmi ultra saf su ile 50 mL’ ye tamamlanmıĢtır. PAGE için hazırlanan yükleme tamponunda SDS ve β-merkaptoetanol kullanılmamıĢtır. Örnek tamponu kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklanmıĢtır. β-merkaptoetanol’ün etkisi zamanla kaybolduğundan gerektiği zaman hazırlanan tampona aynı oranda ilave edilmiĢtir.

Elektroforez tamponu (Yürütme tamponu): 12 g Tris-baz ve 57,6 g glisin ve 2 g SDS karıĢtırılarak hacmi ultra saf su ile 2L’ye tamamlanmıĢtır. Bu tampon için pH ayarlaması gerekmemektedir. PAGE için hazırlanan elektrot tamponunda SDS kullanılmamıĢtır. Hazırlanan tampon kullanılıncaya kadar 4 C’de saklanmıĢtır. Tampon 2-3 kez kullanıldıktan sonra yenilenmiĢtir.

Coomassie Blue G-250 Çözeltisi: 0,10 g Coomassie blue % 50 metanol ve % 10 asetik asit kullanılmıĢtır. Boya önce metanol ve su karıĢımında çözülmüĢ daha sonra asetik asit eklenmiĢtir.

Yıkama Çözeltisi: % 10 metanol ve % 7 asetik asit çözeltisinden oluĢmaktadır. Yöntem

Jelin hazırlanıĢı: Protein kontaminasyonunu ve her türlü kirliliği önlemek için bütün iĢlemler eldiven giyilerek yapılmıĢtır. Elektroforez camları % 70’lik etanolle iyice temizlendikten sonra jelin sızmasını önlemek için standına yerleĢtirilmiĢtir. Cam levhalar arasında sızıntı olup olmadığı kontrol edildikten sonra, hava kabarcığı kalmayacak Ģekilde degaze edilmiĢ % 10’luk ayırma jeli TEMED ve amonyum persülfat ilave edildikten sonra karıĢtırılmıĢtır. Hazırlanan jeller mini elektroforez (Bio-Rad, Mini-PROTEAN, U.S) camları arasına dökülmüĢtür. Ayırma jelinin içeriği çizelge 3.13’de verilmiĢtir.

Jelin havayla temasını kesmek için, üzeri % 70’lik etanolle kapatılmıĢ ve jelin polimerleĢmesi için 30-40 dakika beklenmiĢtir. Süre sonunda ayırma jelinin üzerindeki alkol kurutma kâğıdı ile jele temas etmeden yavaĢ yavaĢ alınmıĢ ve üzerine % 4’lük yoğunlaĢtırma jeli dökülmüĢtür. Tarak, jelle arasında hava kabarcığı kalmamasına ve ayırma jeline değmemesine dikkat edilerek jele yerleĢtirilmiĢ ve polimerleĢmesi için 1-2 saat beklenmiĢtir. YoğunlaĢtırma jelinin içeriği çizelge 3.14’de verilmiĢtir.

Çizelge 3.13 % 10’ luk ayırma jelinin içeriği

Kullanılan malzeme Miktar (mL)

Distile su 2.26

Ayırma tamponu (pH 8.8) 1 % 30’luk akrilamid/bis acrilamid 1,66 % 10’ luk SDS (SDS-PAGE için) 0,05 % 10’luk amonyum persülfat 0,025

TEMED 0,00175

Çizelge 3.14 % 4’ lük yoğunlaĢtırma jelinin içeriği

Kullanılan malzeme Miktar (mL)

Distile su 1,875

YoğunlaĢtırma tamponu (pH 8.8) 0,25 % 30’luk akrilamid/bis acrilamid 0.3375 % 10’ luk SDS (SDS-PAGE için) 0,025 % 10’luk amonyum persülfat 0.0125

TEMED 0.0035

Örneklerin hazırlanıĢı ve jele uygulanıĢı: Jele uygulanacak örnekler ve standart, örnek tamponuyla uygun seyreltmeleri yapıldıktan sonra kaynar su banyosunda 5 dakika kaynatılmıĢtır (PAGE ve zimogram için örnekler kaynatılmamıĢtır). Tarak jele zarar vermeden çekilmiĢ ve jel elektroforez tamponu ile yıkanarak polimerleĢmeyen jel uzaklaĢtırılmıĢtır. Daha sonra kuyucuklar elektroforez tamponu ile doldurulmuĢ ve uygun seyreltmeleri yapılan örneklerden 15 µL yüklenmiĢtir. Örnekler jele yüklendikten sonra jel tankın içine yerleĢtirilmiĢ ve kuyucukların üzerini örtecek Ģekilde elektroforez tamponu eklenmiĢtir. Güç kaynağı (UVP,

Germany) ile üst jele 100 V, alt jele 200 V elektrik akımı verilerek proteinlerin ayırma iĢlemi yapılmıĢtır.

Jelin boyanması: Cam plaklar arasından çıkarılan jelden üst jel ayrılmıĢtır. Boyanın aldığı yol elektronik kumpasla ölçüldükten sonra, ayırma jeli zimogram ve protein boyaması yapılmak üzere ikiye ayrılmıĢtır. Protein boyaması Commasie Brillant mavisi ile 1 saat 100 rpm’de çalkalanarak boyanmıĢtır. Boyamadan sonra jeldeki fazla boya yıkama çözeltisi ile birkaç kez yıkanarak uzaklaĢtırılmıĢ ve bantlar görünür hale gelmiĢtir.

Zimogram: Lipazın zimogramı için tribütirin içeren agar plaklar kullanılmıĢtır. Bu amaçla cam plaklar arasından çıkarılarak ayrılan jel ikiye bölünmüĢ ve bir yarısı zimogram diğer yarısı da protein boyaması için kullanılmıĢtır. Bunun için % 1 tribütirin, 20 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ ve % 0,5 gum arabicten oluĢan çözelti homojenizatörde (IKA T25B, Germany) 3 dakika emülsifiye edilmiĢ ve daha sonra üzerine % 1,5 oranında agar eklenerek karıĢım kaynatılmıĢtır. Zimogram için ayrılan jel petri kabına yerleĢtirilmiĢ ve üzerine hazırlanan tribütirin agar ~50 °C’ye soğutulduktan sonra dökülmüĢtür. Agar katılaĢtıktan sonra petri 50 °C’deki etüvde Ģeffaf bant oluĢana kadar inkübe edilmiĢtir (Oh et al., 1999).

Lipazın molekül ağırlığının belirlenmesi: Elektroforez sonucunda PAGE ve SDS-PAGE sonuçları karĢılaĢtırılarak lipaz bantı belirlenmiĢtir. SDS-SDS-PAGE jelinde boyanın, standartların ve enzimin kat ettikleri mesafeler elektronik kumpas (Mitutoyo, CD-15CP, U.K.) yardımı ile ölçülmüĢtür. Standartların ve enzimin Rf değerleri aĢağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıĢtır;

Daha sonra standartların molekül ağırlıklarının logaritması alınmıĢ ve Rf değerlerine karĢı grafik çizilmiĢtir. Elde edilen standart grafiğin denkleminden yararlanılarak enzimin molekül ağırlığı saptanmıĢtır.

3.2.7. Anoxybacillus flavithermus HBB 134 Lipazının