Saos-2 Hücrelerinde Tip I-II-III Kollajen Genlerinin

C/EBPα transkripsiyon faktörünün Tip I, II, III kollajenlerinin mRNA düzeyine olan etkisinin belirlenebilmesi amacıyla Bölüm 4.7’ de izole edilen RNA’ların 1 µg’ı kullanılarak Bölüm 3.2.6.4’te anlatıldığı şekilde cDNA sentezi yapıldı. Tip I, II, III kollajenlerinin ilgili zaman dilimlerindeki ekspresyon düzeyinin belirlenebilmesi amacıyla Tablo 4.5’ te verilen, kollajenlere özgü tasarlanmış primerler kullanılarak Bölüm 3.2.6.5’te anlatıldığı şekilde birbirinden bağımsız 2 farklı deney kuruldu ve en az 3 tekrarlı olacak şekilde qRT-PCR çalışıldı. Sonuçlar Livak metoduna göre değerlendirildi. p değeri ≤0.05 olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Sonuçlar değerlendirildiğinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün Tip I Kollajen ekspresyonunu 2 kata, Tip II Kollajen ekspresyonunu 1.3 kata ve Tip III kollajen ekspresyonunu yaklaşık 1.2 kata arttırdığı tespit edildi. Özellikle Tip I ve Tip II Kollajen’de elde edilen bu sonuçlar istatistiksel olarak da anlamlı bulundu (Şekil 4.64).

104

Şekil 4.64: Saos-2 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün geçici over ekspresyonunun Tip I-II ve III Kollajen mRNA düzeyinlerine olan etkisi

MG63 Hücrelerinde ADAMTS-3 Geninin C/EBPα ile Regülasyonu

Over ekspresyonu gerçekleştirilmiş olan MG63 hücrelerinden izole edilen RNA’ların 1 µg’ı kullanılarak cDNA sentezi yapıldı. Belirtilen transkripsiyon faktörünün ilgili zaman dilimlerindeki ekspresyon düzeyi C/EBPα cDNA’larına özgün olarak tasarlanmış primerler (Tablo 4.5) kullanılarak qRT-PCR ile Bölüm 3.2.6.5’te anlatıldığı şekilde en az 3 tekrarlı olacak şekilde çalışıldı. Kontrol ve deney grubuna ait değerler Livak metoduna göre insan β-2 mikroglobulin geninin Ct değerine bölünerek normalize edildi ve sonrasında kat olarak belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre C/EBPα transkripsiyon faktörünün MG63 hücrelerinde over ekspresyonunun en fazla 6 saat inkübasyon sonrasında yaklaşık 6,5 kata kadar arttığı belirlendi (Şekil 4.65). C/EBPα ekspresyonu için elde edilen bu sonuç istatistiksel olarak da anlamlı bulundu. Sonuç olarak belirtilen transkripsiyon faktörünün MG-63 hücrelerinde geçici over ekspresyonunun başarılı bir şekilde gerçekleştiği belirlenmiştir. Maksimum ifade oldukları inkübasyon süresinde elde edilen örnekler RNA ve protein çalışmalarında kullanıldı.

105

Şekil 4.65: MG-63 hücrelerinde C/EBPα’nın 6- 24 ve 48 saat sonunda geçici over ekspresyonu sonucu C/EBPα’nın maksimum ifade olduğu inkübasyon süresini

gösteren grafik.

C/EBPα transkripsiyon faktörlerini taşıyan ekspresyon plazmitleri kalsiyum fosfat presipitasyonu ile geçici olarak MG-63 hücrelerine transfeksiyon yöntemi ile aktarıldıktan sonra RIPA solüsyonu kullanılarak elde edilen 50 µg yoğunluğundaki proteinler SDS-PAGE jelde yürütüldü (Şekil 4.66) Western blot yöntemi kullanılarak

ADAMTS-3 antikorları ile proteinler işaretlendi. Normalizasyon amacıyla β-aktin

proteini kullanıldı. Sonuçlar Image J programı ile analiz edilerek değerlendirildi. Yapılan densitometrik analizler sonucunda C/EBPα transkripsiyon faktörünün

ADAMTS-3 protein düzeyini 0.6 kata kadar azalttığı belirlendi. Elde edilen azalma

istatistiksel olarak da anlamlı bulundu (Şekil 4.66).

Şekil 4.66: MG-63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün geçici over ekspresyonu ile ADAMTS-3 geni protein düzeyine olan etkisini gösteren western blot

106

C/EBPα transkripsiyon faktörünün ADAMTS-3 mRNA düzeyine olan etkisinin belirlenebilmesi amacıyla bir önceki bölümde izole edilen RNA’ların 1 µg’ı kullanılarak cDNA sentezi yapıldı. ADAMTS-3 ilgili zaman dilimlerindeki ekspresyon düzeyinin belirlenebilmesi amacıyla ADAMTS-3’e özgü tasarlanmış primerler kullanılarak birbirinden bağımsız 2 farklı deney kuruldu ve en az 3 tekrarlı olacak şekilde qRT-PCR çalışıldı. Yapılan çalışmalar değerlendirildiğinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün ADAMTS-3 mRNA ekspresyon seviyesini daha önce belirlenmiş olan maksimum ifade olduğu inkübasyon süresi sonunda neredeyse tamamen azalttığı istatistiksel olarak da anlamlı bulundu (Şekil 4.67).

Şekil 4.67: MG-63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün geçici over ekspresyonunun ADAMTS-3 mRNA düzeyine olan etkisi.

Kotransfeksiyon analizlerinde 1 µg ADAMTS-3 promotor parçalarıyla birlikte, ilgili transkripsiyon faktörünün MG63 hücrelerinde ektopik ekspresyonunu sağlayacak olan ekspresyon plazmitlerinden 1-2 μg ve normalizasyon amacıyla da 0,5 µg Seap kontrol plazmiti ile birlikte Bölüm 3.2.5.1’de anlatıldığı şekilde kalsiyum fosfat presipitasyonu yöntemi ile geçici olarak MG63 hücrelerine transfekte edildi. Bazal aktivite sonuçları, ekspresyon vektörü transfekte edilen hücrelerdeki lusiferaz aktivitesi sonuçlarıyla karşılaştırılarak değerlendirildi. MG63 hücrelerinde yapılan kotransfeksiyon çalışmalarının sonuçları değerlendirildiğinde uygulanan C/EBPα transkripsiyon faktörünün ADAMTS-3’e ait tüm promotor parçalarının promotor aktivitelerini azalttığı belirlendi. Özellikle TS3 [-1340/+40] ve TS3 [-899/+40] promotor parçalarındaki aktivite azalışı istatistiksel olark da anlamlı bulundu (Şekil 4.68).

107

Şekil 4.68: MG63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün ADAMTS-3 promotor aktivitesine etkileri

4.6.2.2.1 MG63 Hücrelerinde Tip I-II-III Kollajen Genlerinin C/EBPα ile Regülasyonu

Protein düzeyinde ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi amacıyla, C/EBPα transkripsiyon faktörlerini taşıyan ekspresyon plazmitleri kalsiyum fosfat presipitasyonu ile geçici olarak MG63 hücrelerine transfeksiyon yöntemi ile aktarıldıktan sonra RIPA solüsyonu kullanılarak elde edilen proteinler (50 µg) SDS- PAGE jelde yürütüldü (Şekil 4.69) Western blot yöntemi kullanılarak Tip II Kollajen proteinlerine özgü COL2A1 antikoru ile proteinler işaretlendi. Normalizasyon amacıyla β-aktin proteini kullanıldı. Sonuçlar Image J programı ile analiz edilerek değerlendirildi. Yapılan densitometrik analizler sonucunda C/EBPα transkripsiyon faktörünün Tip II Kollajen’in protein düzeyini yaklaşık 0.9 oranına kadar azalttığı belirlendi (Şekil 4.69).

108

Şekil 4.69: MG63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün Tip II Kollajen’in protein düzeyine olan etkisini gösteren membran ve densitometrik analiz sonucu.

MG63 hücrelerinde C/EBPα aşırı ifadesi sonucu elde edilen hücrelerden Bölüm 3.2.6.1’de anlatıldığı şekilde kit prosedürüne uyularak RNA izole edildi. İzole edilen bu RNA’lardan 1µg olacak şekilde kullanılarak Bölüm 3.2.6.4’te anlatıldığı gibi cDNA sentezlendi. Tip I, II, III kollajenlerinin ilgili zaman dilimlerindeki ekspresyon düzeyinin belirlenebilmesi amacıyla Tablo 4.5’ te verilen, kollajenlere özgü tasarlanmış primerler kullanılarak Bölüm 3.2.6.5’te anlatıldığı şekilde birbirinden bağımsız 2 farklı deney kuruldu ve en az 3 tekrarlı olacak şekilde qRT-PCR çalışıldı. Sonuçlar değerlendirildiğinde C/EBPα’nın çalışılan tüm kollajen tiplerinde mRNA seviyesinde ekspresyonu azalttığı gözlendi. Tip II Kollajen ekspresyonunda 0.05 oranına kadar azalma gerçekleşirken (Şekil 4.70), Tip I Kollajen’de 0.3’ e, Tip III Kollajen ekspresyonunda ise 0.2 oranına kadar bir azalma olduğu belirlendi. Alınan tüm sonuçların istatistiksel olarak anlamlı olduğu belirlendi (Şekil 4.71).

Şekil 4.70: MG63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün geçici over ekspresyonunun tip II Kollajenin mRNA düzeyine olan etkisi

109

Şekil 4.71: MG63 hücrelerinde C/EBPα transkripsiyon faktörünün geçici over ekspresyonunun tip I-II-III Kollajenlerinin mRNA düzeyine olan etkisi

4.6.3 İnsan ADAMTS-3 geninin USF Transkripsiyon Faktörü ile