(Fo nte : Hixto n, J.E; Ve rnie r, D.T., 1990)
Fig ura 11: Se q üê nc ia s d e DNA e d a p ro te ína d e re g iõ e s a mp lific a d a s, c o d ific a nd o iso fo rma s c o muns d a a p o E e lo c a liza ç ã o d o s sítio s d e c liva g e m d a Hha I. Sub stituiç õ e s d o s nuc le o tíd io s q ue d isting ue m a s iso fo rma s E2 e E3 sã o mo stra d a s a c ima d a se q üê nc ia d e nuc le o tíd e o s d e E4. As sub stituiç õ e s d e a mino á c id o s sã o mo stra d o s a b a ixo d a se q üê nc ia d e E4 (sítio s d e sub stituiç ã o no s c ó d o ns 112 e 158 e stã o e nq ua d ra d o s). O s sítio s d e c liva g e m d a Hha I na se q üê nc ia d e nuc le o tíd io s d e E4 e stã o sub linha d o s e ind ic a d o s p o r se ta s.
Fig ura 12: Dia g ra ma d o s ma p a s d e c liva g e m p e la e nzima Hha I e se p a ra ç ã o e le tro fo ré tic a d o s fra g me nto s d e re striç ã o , d e p o is d o p ro c e sso d e a mp lific a ç ã o p o r PC R. As se ta s ind ic a m o s p o nto s d e c liva g e m d a e nzima d e re striç ã o Hha I (H) a o lo ng o d o g e ne d a APO E. No ta r q ue no s re síd uo s 112 e 158, o c o rre c liva g e m p e la e nzima Hha I, a o lo ng o d o a le lo E4 (g e ra nd o fra g me nto s d e 72 e 48 p b , ve r e sq ue ma ), c o ntud o , nã o o c o rre c liva g e m no re síd uo 112 no a le lo E3 (g e ra nd o fra g me nto s d e 91, 48 e 35 p b ) e e m a mb o s re síd uo s 112 e 158 no a le lo E2 (g e ra nd o fra g me nto s d e 91 e 83 p b ).
112
H
H
19 72
48
35
91
91
83
48
35
E4
E3
E2
158
Fig ura 13: G e no tip a g e m d a a p o lip o p ro te ína E a p a rtir d a d ig e stã o p e la e nzima d e re striç ã o Hha I, usa nd o DNA p urific a d o d e a mo stra s d e c é lula s b uc a is. O s fra g me nto s d e re striç ã o fo ra m re so lvid o s e m g e l d e a g a ro se a 4%. O g e nó tip o d e c a d a a mo stra é ind ic a d o a c ima d e c a d a linha . L1: 25-p b DNA la d d e r.
100 pb
3.11.1. Pro to c o lo pa ra Se qüe nc ia m e nto do G e ne da APO E
No intuito d e o b te r um d ia g nó stic o g e né tic o a c ura d o d o s p o limo rfismo s d a APO E, ta mb é m re a liza mo s o se q üe nc ia me nto d o DNA-d up la hé lic e e m a lg uma s a mo stra s, a p ó s re a liza r te ste s p ilo to s c o m c o ntro le s inte rno s. De ssa fo rma , p a ra a lg uma s a mo stra s, fize mo s um c o ntra -te ste p o r se q üe nc ia me nto p a ra o b te r um g e nó tip o c o rre to , se m a mb ig üid a d e . Pa ra isso , p urific a mo s o p ro d uto d e a mp lific a ç ã o d e PC R, a p a rtir d o mé to d o Q ia g e n (Q ia -Q uic k PC R Purific a tio n Kit, Q ia g e n). O p ro d uto d e a mp lific a ç ã o fo i g e ra d o a p a rtir d o p rime r, d e sc rito p o r HIXSO N AND VERNIER, 1990, Fig ura 11, o b te nd o um p ro d uto d e 244 p b , c o nfirma d o p o r e le tro fo re se e m g e l d e a g a ro se (2%). O se q üe nc ia me nto fo i re a liza d o a p ó s e nvio d o p ro d uto p urific a d o d e PC R p a ra o De p a rta me nto d e Mic ro b io lo g ia , no se to r d e Pe sq uisa Bio mo le c ula r d a Unive rsid a d e d e Virg ínia (C ha rlo tte sville , VA, USA). O Q ua dro 2 mo stra o se q üe nc ia me nto d a re g iã o a mp lific a d a d o g e ne d a APOε3 huma na .
Em suma , fo ra m a d ic io na d o s 200μl d e ta mp ã o PB (d e a c o rd o , c o m a s re c o me nd a ç õ e s d o fa b ric a nte ) p a ra 40μl d o p ro d uto d e a mp lific a ç ã o d e PC R (1:5). Utiliza nd o a c o luna d e filtra ç ã o (Q IAq uic k) num tub o e p p e ndo rf (2,0 ml), c e ntrifug a mo s p o r 30-60 s (∼ 13.000 rp m), e e m se g uid a , d e sc a rta mo s o filtra d o , re c o lo c a nd o a c o luna no me smo tub o . Em se g uid a , a d ic io na mo s 0,75 ml d o ta mp ã o PE, re p e tind o o p ro c e sso d e c e ntrifug a ç ã o (30-60 s) e d isc a rta nd o o filtra d o . C e ntrifug a mo s ma is uma ve z e m a lta ve lo c id a d e p o r 1 minuto . C o lo c a mo s a c o luna e m um no vo tub o e sté ril e p a ra o b te r o vo lume fina l, a d ic io na mo s 50μl d e ta mp ã o EB (10mM Tris-C l, p H 8.5) e c e trifug a mo s a c o luna p o r 1 minuto . O se q üe nc ia me nto fo i re a liza d o usa nd o o siste ma Prism DNA Se q ue nc e r.
Q ua dro 2: Se q üe nc ia me nto d a re g iã o a mp lific a d a d o g e ne d a APO E huma na . Em ne g rito e stã o o s re síd uo s 112-T e 158-C . O s c ó d o ns TG C (p a ra C is) e C G C (p a ra Arg ), c a ra c te riza m o a le lo ε3, o ma is a mp la me nte d istrib uíd o no mund o .
G NTC G G C G G C G C G G C C C G G C TG G G C NC G G AC ATG G AG G AC G TGTG C G G C C G C C TG G TG C AG TAC C G C G G C G AG G TG C AG G C C ATG C TC G G C C AG AG C AC C G AG G AG C TG C G G G TG C G C C TC G C C TC C C AC C TG C G C AAG C TG C G TAAG C G G C T C C TC C G C G ATG C C G ATG AC C TG C AG AAGCG C C TG G C AG TG TAC C AG G C C G G G G G C G AATTC TG TANNNNNNNNNNNANNAC N
3.12. Antro po m e tria e Indic a do re s de Nutriç ã o
Utiliza mo s o siste ma d a O rg a niza ç ã o Mund ia l d e Sa úd e (O MS) p a ra d e finir um c a so d e d ia rré ia , c o mo fo i d e sc rito p o r (MO O RE e t a l, 2001). Ap ó s o tre ina me nto d o s inve stig a d o re s e te sta nd o p a ra re p ro d utib ilid a d e (e ntre 0,1 c m d e c o mp rime nto e 0,1 kg p e so ). A e q uip e d e c a mp o me d iu a a ltura e p e so d a s c ria nç a s e nvo lvid a s no e stud o . O c o mp rime nto fo i me d id o sup ino a o p o nto ma is p ró ximo c o m ma rg e m d e 0,1c m, c o m uma fita mé tric a . As me d id a s d e c o mp rime nto fo ra m c o nve rtid a s e m z e sc o re s d a a ltura -p o r-id a d e (HAZ) e o p e so fo i c o nve rtid o e m z e sc o re s d o p e so -p o r-id a d e (WAZ), a mb o s ind ic a d o re s fo ra m c o nve rtid o s e m z e sc o re s d e p e so - a ltura -p o r-id a d e (WHZ), utiliza nd o o so fwa re p a ra e stud o a ntro p o mé tric o Ep iInfo , 2002. Utiliza mo s o s ind ic a d o re s d o no vo NHANES III p a ra re fe re nc ia r o s d a d o s. Essa s me d id a s a ntro p o mé tric a s e m z e sc o re s c o rre sp o nd e m a o núme ro d e d e svio s p a d rã o a c ima o u a b a ixo d o s va lo re s d e me d ia na d o C e ntro Na c io na l d e Esta tístic a e m Sa úd e (NC HS), c o mo re fe rê nc ia inte rna c io na l p a ra p o p ula ç õ e s (WHO , 1997), ve r Q ua dro 3.
A me d id a d o c o mp rime nto sup ino e d a p e rime tria c e fá lic a o c c ip ito -fro nta l fo i c o nd uzid a c o mo d e sc rito p o r (ZEMEL, RILEY, STALLING S, 1997), a ssumind o q ue a fo rma d a c a b e ç a é d e te rmina d a d ura nte o s p rime iro s me se s d e vid a . Em c irc urstâ nc ia s no rma is, o c re sc ime nto rá p id o e c o ntínuo d o c é re b ro e m c re sc ime nto mo ld a o c râ nio no se ntid o d e a c o mo d á -lo . A fa lta d e fusã o firme d o s o sso s c ra nia no s a o lo ng o d a c o nve xid a d e c ra nia na p e rmite o a ume nto d o c râ nio p a ra a c o mo d a r o c é re b ro e m c re sc ime nto . Muito s e stud o s c o nfirma m a re la ç ã o e ntre o ta ma nho d a c a b e ç a e o s e sc o re s d e Q I (Q uo c ie nte d e Inte lig ê nc ia ). Um fo rma to re d uzid o d a c a b e ç a p o d e ind ic a r d istúrb io s d o d e se nvo lvime nto c e re b ra l, inc luind o p ro life ra ç ã o ne uro na l, mig ra ç ã o e p ro c e sso s e nc e fa lo c lá stic o s (HANSEN& LO U, 2000; NELLHAUS, 1968; NELSO N& DEUTSC HBERG ER, 1970). Alé m d isso , a p e rime tria c e fá lic a , c o mo um ind ic a d o r d o p e rfil nutric io na l p a ssa d o e d o d e se nvo lvime nto c e re b ra l, te m sid o d e sc rita c o mo o p a râ me tro a ntro p o mé tric o c o m me lho r va lo r p re d itivo p a ra o d e se mp e nho e sc o la r e p a ra va ria b ilid a d e d a c a p a c id a d e inte le c tua l (DESC H, ANDERSO N, SNO W, 1990; IVANO VIC e t a l, 2002).
Q ua dro 3: Me d id a s a ntro p o mé tric a s e m z e sc o re s c o rre sp o nd e nd o a o núme ro d e d e svio s p a d rã o a c ima o u a b a ixo d o s va lo re s d e me d ia na d o C e ntro Na c io na l d e Esta tístic a e m Sa úd e (NC HS), c o mo re fe rê nc ia inte rna c io na l p a ra p o p ula ç õ e s (WHO , 1997).
Indicadores de Desnutrição