2.3. Doğum Sonrası
2.3.12. Sünnet
Spondias sp., objeto deste estudo, contém diversos grupos de substâncias químicas. Taninos, lactonas, terpenóides (sesquiterpenos e monoterpenos), flavonóides são algums desses grupos de substâncias já detectadas e isoladas que ocorrem em outras espécies do gênero Spondias. (MENDES & ELISALDO, 2007; TALHOUK et al., 2007).
No caso específico do fruto do cajá-umbu, estudos fitoquímicos indicaram a presença de altos teores de vitamina C e glicídios, sendo, de maneira geral, uma fonte natural de antioxidante (ALMEIDA, 2000).
Araujo-Silva (2009) ao avaliarem a fitoquímica dos extratos e frações de folhas de Spondias sp. determinaram a marcada presença de composto de natureza fenólica (taninos, flavonóides, saponinas); os quais são conhecidos por apresentarem capacidade antioxidante e propriedades antiinflamatórias (ESQUENAZI et al., 2002; GUTAM & JACHAK, 2009).
Assim, essas substâncias podem ser responsáveis, de maneira total ou parcial, pelas atividades biológicas dos extratos brutos e das frações obtidos do extrato metanólico.
5.2.1 CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓLICOS
A concentração de polifenólicos totais foi determinada pelo método de Folin- Ciocalteau, conforme o procedimento descrito por GEORGÉ et al. (2005), obtendo uma concentração em equivalente de acido gálico consideravelmente maior para o extrato metanólico (12,08±1,20 mg de Eag/100 mg de extrato) em comparação ao extrato aquoso (6,90±0,47 mg de Eag/100 mg de extrato) e extrato etanólico (8,12±0,22 mg de Eag/100 mg de extrato).
5.2.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO COMPOSTO MAJORITÁRIO Após a maceração das folhas de Spondias sp. em metanol por 3 dias, para obtenção do extrato bruto, foi rotaevaporado, após seco foram fracionado por solventes de polaridade crescente, obtendo-se as frações hexânica, cloroformica, acetato de etila e precipitado (Fração rica em Flavonoides). A Fração rica em Flavonoides (FRF), foi fracionada em coluna de Sephadex LH20, isolando o composto majoritário, um sólido amorfo de coloração amarelada, com ponto de fusão de 181ºC (170-187ºC) e entalpia de -110ºC, por calorimetria diferecial exploratória. O sresultados obtidos estão de acordo com o mostrado na inclução de rutina em complexo sacarídeos (SRI et al., 2007) (Figura 10).
Figura 10. Gráfico de calorimetria exploratória diferencial (DSC) do padrão de rutina e do composto isolado. A rutina padrão (linha superior) e o composto isolado (linha inferior) apresentaram pontos de fusão de 177 ºC (166 -184ºC); 181ºC (170-187ºC) e entalpias de -98ºC e -110ºC, respectivamente.
Os espectros de UV para flavonóides, em MeOH, exibem duas bandas de maior absorção na região de 240-400 nm. A banda I absorve entre 300- 380 nm e a banda II entre 240-280 nm. A banda I se refere ao anel B (cinamoil) e a banda II representa o anel A (benzoil).
Os espectros de UV obtidos de acordo com Mabry, Markham e Thomas (1970), são apresentados na figura 11. O composto isolado, em metanol (Fig. 11A), apresentou bandas ( max) em 398 nm, referentes ao anel B, e em 263 nm, referentes ao anel A. Valores próximos aos apresentado pelo padrão de rutina, 398 nm e 266 nm (Fig.11D).
A presença de AlCl3 forma complexos estáveis com compostos que têm grupos
hidroxila em C-3 ou C-5, e complexos menos estáveis (lábeis) com grupos ortodiidroxila. O complexo formado com os grupos ortodiidroxila decompõe-se rapidamente, mas a complexação com o grupamento cetona na posição 4 e o grupo 5-hidroxila formam um complexo estável na presença do ácido HCl. Com adição de HCl ocorre um deslocamento hipsocrômico da banda I (30-40nm) devido à decomposição do complexo com o grupo ortodiidroxila, verificando-se assim a presença deste grupo no anel B. Ainda com HCl na presença de AlCl3
é possível verificar a presença dos grupos 3 e/ou 5-hidroxila. Espectros de substâncias com esses grupamentos apresentam a banda I com deslocamento batocrômico em relação ao espectro com MeOH; para 3,5-hidroxiflavonas esse deslocamento é em torno de 50-60nm, para 5-hidroxiflavonas com a posição 3 substituída é de 35-55nm, e já para 3- hidroxiflavonas em torno de 60nm. O espectro original em MeOH do composto isolado apresentou bandas em ( max) 355, 257 e 267(ombro), características das bandas I e II de flavonóides. A banda I relativa ao anel B sofreu um deslocamento hipsocrômico de 18 nm em relação à quercetina este efeito é devido à substituição em C-3 (SANTOS, SCHRIPSEMA e KUSTER, 2005; KALEGARI, 2009).
O espectro com AlCl3 revelou bandas em ( max) 436, 303(ombro) e 275nm,
deslocamento batocrômico das duas bandas, sugerindo a presença de sistema ortodiidroxila e hidroxila em C-5. A adição de HCl deslocou estas bandas para ( max) 400, e 270nm. Esse deslocamento hipsocrômico, na presença de HCl em relação ao espectro com AlCl3, da banda I confirma a presença
ortodiidroxila no anel B. Em relação ao espectro original em metanol o deslocamento batocrômico da banda I foi de 45nm, referente a presença do grupamento 5-hidroxila com a posição 3 substituída. Identificando a aglicona como um flavonol-3-O glicosilado, com hidroxilas no anel B substituídas em 3‟ e 4‟, caracterizada como quercetina.
Os deslocamentos químicos de RMN 13C e 1H foram obtidos com solvente metanol à 60 e 300 MHz, respectivamente. Os espectros de RMN-13C
revelaram a presença dos 15 carbonos características da estrutura básica dos flavonóides e mais 11 carbonos entre 60 e 105 ppm, região característica de açúcar, referentes a duas unidade de açúcar, sendo duas hexoses, uma glicose e outra ramnose, caracterizada pelo CH3 com deslocamento de 17 ppm,
totalizando uma estrutura com 27 carbonos. No espectro de RMN-1H foram
observados os deslocamentos na região de 6-8 ppm referentes aos anéis aromáticos de flavonóides, além de deslocamentos na região de 3-4,6 ppm, característicos de açúcares, confirmando assim a presença de duas unidades de açúcares.
Figura 11. Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto isolado (A), composto isolado + AlCl3 (B), composto isolado + AlCl3 + HCl (C), rutina
Os deslocamentos de RMN-13C e os hidrogênios em δ 6,9 (H5‟), δ 7,5 (H2‟), δ
7,4 (H6‟), correspondentes ao anel B, e os hidrogênios em δ 6,2 (H6) e δ 6,38 (H8) correspondentes ao anel A, evidenciam que o composto é um derivado da quercetina. A localização do glicosídeo é dada pelo deslocamento, em relação ao espectro da quercetina, observado em C-3 e C-2. Neste composto C-3 está protegido em torno de 3 ppm e C-2 foi desprotegido em torno de 10ppm, deslocamento que só pode ocorrer com a presença de uma substituição em C- 3, comprovando assim a presença da unidade de açúcar nesta posição.
Tabela 04. Deslocamentos Quimicos (ppm) de RMN-13C e RMN-1H do
composto isolado, padrão rutina e lituratura.
Posição 13C Experimental 1H J (Hz) 13C Padrão (Rutina) 1H J(Hz) 13C HENEIDAK 2009 1H J(Hz)
2 158.50 - - 158.46 - - 156.5 - - 3 135.62 - - 138.17 - - 133.2 - - 4 179.42 - - 174.23 - - 177.3 - - 5 162.94 - - 162.90 - - 161.2 - - 6 100.00 6.20 d 2.0 99.95 6.20 d 2.0 98.7 6.2 d 2.1 7 166.04 - - 166.00 - - 164.5 - - 8 94.92 6.40 d 2.0 94.87 6.40 d 2.0 93.6 6.4 d 2.1 9 159.37 - - - - - 156.4 - - 10 105.64 - - 104.71 - - 103.7 - - 1‟ 123.12 - - 123.09 - - 121.5 - - 2‟ 117.72 7.66 2.0 116.05 7.67 d 2.0 116.2 7.53 d 2.0 3‟ 149.82 - - 149.78 - - 115.2 - - 4‟ 145.84 - - 143.09 - - 148.5 - - 5‟ 116.10 6.85 d 8.2 116.20 6.87 d 8.2 115.2 6.83 d 9.0 6‟ 123.59 7.63 dd 2.0 8.0 123.56 7.64 dd 2.0 8.0 121.0 7.75 dd 2.4 7.8 Glicose 1‟‟ 104.6 5.10 d 7.4 103.91 5.11 d 7.4 101.2 5.44 d 7.2 2‟‟ 73.95 - - 73.91 - - 75.8 - - 3‟‟ 78.17 - - 78.15 - - 74.0 - - 4‟‟ 71.41 - - 71.36 - - 69.9 - - 5‟‟ 75.74 - - 75.71 - - 76.4 - - 6‟‟ 68.57 - - 66.50 - - 66.9 - - Ramnose 1‟‟‟ 102.43 4.52 d 1.10 102.39 4.52 d 1.10 100.7 4.38 d 1 2‟‟‟ 72.26 - - 72.21 - - 70.5 - - 3‟‟‟ 72.11 - - 72.08 - - 70.3 - - 4‟‟‟ 73.94 - - 73.92 - - 71.8 - - 5‟‟‟ 69.73 - - 69.70 - - 68.2 - - 6‟‟‟ 17.90 1.10 d 6.20 17.89 1.11 d 6.20 17.6 0.99 d 6.0
Nota: d=dubleto, dd=duplo dubleto, J=constante de acoplamento
Os dados de RMN-13C são de grande valia na determinação da estrutura de um
flavonóide glicosilado, pois a partir destes dados é possível estabelecer o número de açúcares ligados, a natureza dos mesmos, assim como a posição, configuração e conformação (AGRAWAL 1989). A identificação do açúcar do
composto isolado foi baseada por comparação com os espectros obtidos com o padrão de rutina e espectros da literatura e foi definido como rutosideo (uma unidade de glicose, outra de ramnose) (Tabela 04). O experimento DEPT revelou a presença de apenas um CH2 68.57 ppm, característico de glicosídeo.
Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura. O composto isolado e identificado como quercetina-3-O-rutosídeo (Rutina) é inédito para a espécie em estudo ao se revisar a literatura (Figura 12).
Figura 12. Estrutura química da rutina
A rutina é um flavonóide amplamente distribuído no reino vegetal, com elevada capacidade antioxidante na remoção de radicais livres, exercendo assim um papel citoprotetor. Além desta atividade este flavonóide apresenta atividade antiinflamatória, imunomoduladora e antitumoral (BÜRGER, 2008).