Para a purificação parcial da frutano-exohidrolase (FEH) foram utilizados rizóforos de plantas de V ernonia herbacea cultivadas sob condições ambientais naturais de campo da Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. As extrações enzimáticas foram realizadas com rizóforos de plantas em fase vegetativa induzidas à brotação. Para a indução à brotação, as plantas foram podadas na altura do solo e mantidas no solo por 17 dias; após este período, os rizóforos destas plantas foram coletados, lavados e armazenados a frio (5ºC) por 7dias.
Os extratos enzimáticos utilizados na caracterização e estudo de especificidade da FEH foram preparados de plantas induzidas, conforme descrito acima, ou de plantas em fase natural de brotação.
4.2.2 E xtração e purificação das frutano-exohidrolases
Os rizóforos foram homogeneizados em liquidificador em tampão citrato-
mercaptoetanol e 10% de polivinil polipirrolidona (PVPP) (w/v). Toda a manipulação do material durante a extração foi realizada a 5º C. O homogeneizado foi mantido em repouso por 30 min e, em seguida, filtrado em nylon duplo. Após centrifugação a 13.000 g por 20 min, o precipitado, consistindo principalmente de frutano residual, foi descartado e ao sobrenadante foi adicionado sulfato de amônia a 20% de saturação, sendo a mistura mantida em repouso por uma noite. Após centrifugação a 13.000 g por 20 min, o precipitado foi descartado e ao sobrenadante foi adicionado sulfato de amônia a 80% de saturação. A mistura foi mantida em repouso por uma noite. A proteína precipitada foi coletada por centrifugação a 13.000g por 20 min. O precipitado foi ressuspendido em tampão acetato de sódio 50mM pH 5,0 contendo 1 mM de cloreto de manganês, 1 mM de cloreto de magnésio e 1 mM de cloreto de cálcio e mantido em geladeira por uma noite para a precipitação de frutano residual. Após centrifugação a 5.000g por 15 min, o precipitado foi descartado e o sobrenadante, denominado extrato bruto, submetido à cromatografia de afinidade em coluna (15x140 mm) Concanavalina A (Con A) Sepharose (Pharmacia Biotech) equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5.0 contendo 1mM de cloreto de manganês, 1 mM de cloreto de magnésio e 1
mM de cloreto de cálcio, com um fluxo de 3,0 ml. min-1. Após a lavagem da coluna
com três volumes do mesmo tampão, as proteínas ligadas foram eluidas com 1.0 M
de metil
α
D-mano-piranosídeo em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5.0. Asfrações contendo atividade hidrolítica foram reunidas e tiveram o pH ajustado para 8.0 com tampão Tris HCl 1M, sendo em seguida aplicadas em uma coluna de troca aniônica Mono Q (Pharmacia HR 5/5), equilibrada previamente com tampão Tris HCl 20 mM, pH 8.0. As proteínas foram eluidas utilizando-se um gradiente linear de
0 a 500 mM de NaCl em 76 min (fluxo de 1 ml min-1) no mesmo tampão. As
frações ativas foram reunidas e dialisadas em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5.0 sendo realizadas três trocas. As proteínas foram aplicadas em uma coluna de troca catiônica Mono S (Pharmacia HR 5/5) equilibrada com tampão acetato de
sódio 50 mM, pH 5.0. As proteínas foram eluidas utilizando-se um gradiente linear
de 0 - 500 mM de NaCl em 75 min (fluxo de 1 ml min-1) no mesmo tampão. As
frações com alta atividade hidrolítica foram reunidas e armazenadas a -20 ºC.
As proteínas foram mantidas no gelo durante toda as etapas da purificação. Azida de sódio foi adicionada em todos os tampões para prevenir crescimento microbiano.
4.2.3 Determinação do peso molecular
As frações da Mono S com alta atividade enzimática foram dialisadas por uma noite contra tampão fosfato 50 mM pH 7,0 e cromatografadas em coluna de exclusão molecular Superose 12 (Pharmacia 10/30), equilibrada com tampão fosfato
50 mM pH 7,0, contendo 150 mM de NaCl, com um fluxo de 0,5 ml min-1. A
calibração da coluna foi feita com "Blue Dextran" (2.000 kDa), para determinação do volume vazio e com os padrões de massa molecular: ribonuclease (15,7 kDa), ovoalbumina (47,9 KDa), albumina de soro bovino (68,3 KDa) e aldolase (170 kDa). A massa molecular aproximada das enzimas das amostras foi calculada empregando-se a equação da reta obtida através dos volumes de eluição de cada padrão, contra os logaritmos das massas moleculares dos mesmos.
4.2.4 Conteúdo de proteína
Os conteúdos de proteína nos extratos enzimáticos foram estimados pelo método de Bradford (1976) com o reagente da Bio Rad. Albumina de soro bovina
4.2.5 E nsaio E nzimático
Durante os diferentes passos de purificação, a atividade enzimática foi medida a partir da incubação do substrato com o extrato enzimático na proporção de 1:1 (v/v).
Para a análise da atividade da FEH, os substratos utilizados foram inulina de
H. tuberosus (frutanos com grau de polimerização aproximado de 35) e nistose, o
tetrassacarídeo da série da inulina, nas concentrações finais de 50mg ml-1 e 0,1M,
respectivamente, ambos preparados em tampão citrato-fosfato 50mM, pH 4,5. As incubações foram realizadas a 30 ºC. Alíquotas das misturas de incubação foram submetidas à fervura por 5 min para interrupção da reação e congeladas para posterior análise dos produtos formados.
4.2.6 Análise das atividades enzimáticas
A atividade da FEH foi determinada pela quantificação da frutose liberada na mistura de incubação, através da quantificação de açúcar redutor, de acordo com
Somogyi (1945), utilizando-se frutose (100
µ
g ml-1) como padrão. As análisesqualitativas foram realizadas por cromatografia de troca aniônica de alta resolução e detecção por pulso amperométrico (HPAEC/PAD) em sistema Dionex modelo DX-300 e coluna Carbo Pac PA1. Alíquotas das misturas de incubação foram
diluídas 100x em água deionizada e filtradas em filtros de 0.45
µ
m (Spartan – 3, daAldrich). O gradiente foi estabelecido misturando-se o eluente A (150 mM de NaOH) e eluente B (500 mM de acetato de sódio em 150 mM de NaOH). As incubações com o substrato nistose foram analisadas com a seguinte programação : 0-2 min, 25 mM; 2,1-8 min, 50-350 mM; 8,1-13 min, 350-500 mM; 13,1-15 min, 500 mM; 15,1-17 min, 25 mM. As incubações com o substrato inulina foram analisadas com a seguinte programação: 0-2 min, 25 mM; 2,1-8 min, 50-350 mM; 8,1-28 min,
350-500 mM; 28,1-30 min, 500 mM; 30,1-32 min, 25 mM. Os potenciais aplicados ao PAD para E1 (480ms), E2 (120ms) e E3 (60ms) foram 0,05, 0,60 e -0,60,
respectivamente. O fluxo aplicado foi de 1ml min-1. O padrão de eluição do fruto-
oligossacarídeos foi comparado com padrões obtidos de tubérculos de H. tuberosus.
4.2.7 Caracterização da frutano-exohidrolase
A caracterização da hidrolase envolvida na despolimerização de frutanos foi realizada utilizando-se extrato enzimático bruto e inulina extraída de rizóforos de V .
herbacea como substrato.
A curva de tempo foi obtida por incubação por 0, 15, 30 min e 1, 2, 4, 6 e 8 horas, a 30 ºC. O pH ótimo foi determinado através de ensaios em tampão citrato- fosfato 50 mM e pH entre 3,5 e 7,0 a 30º C, por 4 horas e a temperatura ótima de incubação foi determinada através de ensaios realizados entre 0 e 60 ºC, pH 4,5, por 6 horas. A curva de concentração de substrato foi determinada por incubação com
inulina em concentrações de 10 a 80 mg ml-1, a 30º C, pH 4,5, por 18 horas.
4.2.8 E specificidade da frutano-exohidrolase sobre diferentes substratos
As incubações da FEH com substratos de diferentes graus de polimerização
(GP) e com ligações
β
- 2,1 eβ
-2,6 foram realizadas utilizando-se extrato enzimáticobruto. Os substratos foram preparados em tampão citrato-fosfato 50 mM, pH 4,5 e as atividades determinadas por incubação por 0, 15, 30 min e 1, 2, 4, 6 e 8 horas, a 30º C. Utilizaram-se como substratos: sacarose, o trissacarídeo 1-cestose, o
tetrassacarídeo nistose nas concentrações finais de 100 mM, inulinas (ligações
β
-2,1concentrações finais de 50 mg ml-1 e levano (ligações
β−
2,6 entre os resíduos defrutose) de G. macrocephala na concentração final de 33 mg ml-1, estas últimas
extraídas e purificadas no laboratório da Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas do Instituto de Botânica.
4.2.9 Análise das proteínas purificadas
As análises qualitativas das proteínas foram efetuadas através de eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS – PAGE), empregando- se um sistema descontínuo, baseado no método descrito por Laemmli (1970) e utilizando géis com 10% de poliacrilamida em tampão Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, pH 8,3, contendo 0,1% de dodecil sulfato se sódio (SDS). Foram utilizados mini- géis (9X6 cm) de 0,75 mm de espessura, montados em cuba vertical de eletroforese modelo mini-protean (Bio-Rad). Como marcadores de massa molecular foram utilizados fosforilase b (97,4 kDa), albumina de soro bovino (66 kDa), ovoalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (31 kDa), inibidor de tripsina (21,5 kDa) e lisosima (14,4 kDa), todos integrantes do conjunto para calibração de baixo peso molecular da Bio-Rad. Os géis foram fixados em uma solução de 30% de ácido acético e 10% de metanol e lavados três vezes com água deionizada. Em seguida adicionou-se solução de nitrato de prata e deixou-se em repouso por 30 min sob agitação. Os géis foram lavados rapidamente com água deionizada e em seguida foi adicionada uma solução de 2,5% de carbonato de prata contendo 0,02% de formaldeido. Os géis foram agitados até que as bandas ficaram suficientemente nítidas, interrompendo-se a revelação imediatamente pela adição de ácido acético 5%.