2. GENEL BİLGİLER
2.9. LC-MS/MS
3.2.5. LC-MS/MS Metot Validasyon Çalışmaları
3.2.5.3. Recovery (Geri Elde) ve Matriks Etkisi Çalışmaları
Geri elde ve matriks etkisi çalışmaları EDTA’lı tüpten elde edilmiş KKD/hemolizat ve heparinli tüpten elde edilmiş KKD/hemolizat örneklerinin kullanıldığı yöntemler için ayrı ayrı yapıldı. EDTA’lı tam kan örneklerinin eşit hacimlerde karıştırılmasıyla EDTA’lı tam kan havuzu, heparinli tam kan örneklerinin eşit hacimlerde karıştırılmasıyla ise heparinli tam kan havuzu oluşturuldu. Bu havuzlardan 60’ar µL tam kan Gutrie kartlarına damlatılarak KKD örnekleri elde
48 edildi. Daha sonra EDTA’lı ve heparinli tüplerde kalan kan örneklerinden hemolizatlar elde edildi. Aynı antikoagülanlı tüpten elde edilmiş hemolizatlar eşit hacimde karıştırlarak hemolizat örnekleri oluşturuldu. Özetlemek gerekirse geri elde ve matriks etkisi çalışmalarında: EDTA’lı tüplerden elde edilmiş hemolizat örneği, heparinli tüplerden elde edilmiş hemolizat örneği, EDTA’lı tüplerden elde edilmiş KKD örneği, Heparinli tüplerden elde edilmiş KKD örneği kullanıldı.
Standartların reaksiyon ortamında oluşturduğu [13C
6]-UDP-Gal konsantrasyonları 1 µM (düşük) ve 20 µM (yüksek) olacak şekilde çalışma planı oluşturuldu. İki seviye için %matriks etkisi ve %geri elde hesaplandı.
3.2.5.3.1. Matriks Etkisi Çalışmaları
Matriks etkisi çalışmaları için çalışma örnekleri iki gruba ayrıldı. A grubu matriks içermeyen çalışma örneklerini, B grubu ise matriks içeren çalışma örneklerini temsil etti. Substratsız miks kullanılarak yapılan çalışma prosedürünün son aşamasında reaksiyon ortamında düşük (1 µM) ve yüksek (20 µM) konsantrasyonları sağlayacak [13C
6]-UDP-Gal standartları iki gruba da eklendi. Daha sonra çalışma örnekleri LC-MS/MS’e verilerek belirlenen alıkonma zamanında oluşturdukları [13C
6]-UDP-Gal pik alanları hesaplandı. Matriks etkisi aşağıdaki formül kullanılarak her seviye ve her örnek tipi için hesaplandı:
Matriks etkisi (%) =
[
B A] x
100 =[
B grubunda hesaplanan [13C 6]-UDP-Gal alanı A grubunda hesaplanan [13C 6]-UDP-Gal alanı] x
100 KKD yöntemiA grubu örneklerinin hazırlanması: Bu gruptaki örnekler içerdikleri standart seviyelerine göre “neat düşük” ve “neat yüksek” olarak adlandırıldı.
Neat düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 35 µL substratsız miks ve 5 µL 1 µM İS eppendorfa eklenir, 1 dk 16000 g’de santrifüjlenir. 2. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir.
3. 5 dk kaynar suda bekletilir.
4. 80 µL ACN/su çözeltisi eklenir ve 16000 g’de 10 dk santrifüjlenir.
5. Toplam 120 µL’lik hacmin 90 µL’si LC-MS/MS plağına alınır, üzerine neat düşük için 10 µL 10/3 µM [13C
6]-UDP-Gal, neat yüksek için 10 µL 200/3 µM [13C6]-UDP-Gal standardı eklenir.
49 6. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C6]-UDP-Gal ve İS pik alanları
hesaplanır.
B grubu örneklerinin hazırlanması: Bu gruptaki örnekler içerdikleri standart seviyelerine göre “matriks düşük” ve “matriks yüksek” olarak adlandırıldı.
Matriks düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 32 µL substratsız miks, 5 µL 1 µM İS, 1 panç KKD örneği eppendorfa eklenir ve 1 dk 16000 g’ de santrifüjlenir.
2. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir. 3. 5 dk kaynar suda bekletilir.
4. 80 µL ACN/su çözeltisi eklenir ve 16000 g’de 10 dk santrifüjlenir.
5. Toplam 120 µL’lik hacmin 90 µL’si LC-MS/MS plağına alınır, üzerine matriks düşük için 10 µL 100/3 µM [13C
6]-UDP-Gal, matriks yüksek için 10 µL 200/3 µM [13C6]-UDP-Gal standardı eklenir.
6. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C6]-UDP-Gal ve İS pik alanları hesaplanır.
Hemolizat yöntemi
A grubu örneklerinin hazırlanması: Bu gruptaki örnekler içerdikleri standart seviyelerine göre “neat düşük” ve “neat yüksek” olarak adlandırıldı.
Neat düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 40 µL substratsız miks ve 5 µL 1 µM İS eppendorfa eklenir, 1 dk 16000 g’de santrifüjlenir. 2. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir.
3. 5 dk kaynar suda bekletilir.
4. 75 µL ACN/su çözeltisi eklenir ve 16000 g’de 10 dk santrifüjlenir.
5. Toplam 120 µL’lik hacmin 90 µL’si LC-MS/MS plağına alınır, üzerine neat düşük için 10 µL 3.75 µM [13C6]-UDP-Gal, neat yüksek için 10 µL 75 µM [13C6]-UDP-Gal standardı eklenir. 6. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C6]-UDP-Gal ve İS pik alanları
hesaplanır.
B grubu örneklerinin hazırlanması: Bu gruptaki örnekler içerdikleri standart seviyelerine göre “matriks düşük” ve “ matriks yüksek” olarak adlandırıldı.
Matriks düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 32 µL substratsız miks, 5 µL 1 µM İS, 8 µL hemolizat eppendorfa eklenir ve 1 dk 16000 g’de santrifüjlenir.
50 2. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir.
3. 5 dk kaynar suda bekletilir.
4. 75 µL ACN/su çözeltisi eklenir ve 16000 g’de 10 dk santrifüjlenir.
5. Toplam 120 µL’lik hacmin 90 µL’si LC-MS/MS plağına alınır, üzerine matriks düşük için 10 µL 3.75 µM [13C
6]-UDP-Gal, neat yüksek için 10 µL 75 µM [13C6]-UDP-Gal standardı eklenir.
6. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C
6]-UDP-Gal ve İS pik alanları hesaplanır.
3.2.5.3.2. Recovery (Geri Elde) Çalışmaları
Yöntem doğruluğu geri elde çalışmalarıyla değerlendirildi. Bu amaçla substratsız miks kullanılarak yapılan çalışma prosedürünün ilk aşamasında, reaksiyon ortamında düşük (1 µM) ve yüksek (20 µM) konsantrasyonları sağlayacak [13C
6]-UDP-Gal standartları eklenerek örnekler hazırlandı. Daha sonra çalışma örneklerinin belirlenen alıkonma zamanında [13C
6]-UDP-Gal alanı/İS alanı oranına karşılık gelen konsantrasyonları hesaplandı. 1 µM ve 20 µM hedef değerler kabul edildi. %Geri elde aşağıdaki formül kullanılarak her seviye ve her örnek tipi için ayrı ayrı hesaplandı:
%Geri elde =
[
Ölçülen [ 13C6]-UDP-Gal konsantrasyonu
Hedeflenen [13C
6]-UDP-Gal konsantrasyonu
] x
100
KKD yöntemi: Düşük seviye “recovery düşük”, yüksek seviye “recovery yüksek” olarak adlandırıldı.
Recovery düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 28 µL substratsız miks, 5 µL 1 µM İS, 1 panç KKD örneği eppendorfa eklenir.
2. Recovery düşük için 4 µL 10 µM [13C6]-UDP-Gal, recovery yüksek için 4 µL 200 µM [13C6]- UDP-Gal standardı eklenir. 1 dk 16000 g’de santrifüjlenir.
3. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir. 4. 5 dk kaynar suda bekletilir. 5. 80 µL ACN/su çözeltisi eklenir.
6. 16000 g’de 10 dk santrifüjlendikten sonra supernatant LC-MS/MS’e verilir. 7. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C
6]-UDP-Gal ve İS pik alanları hesaplanır.
51
Hemolizat yöntemi: Düşük seviye “recovery düşük”, yüksek seviye “recovery yüksek” olarak adlandırıldı.
Recovery düşük/yüksek (n=5) seviyenin hazırlanması:
1. 27.5 µL substratsız miks, 5 µL 1 µM İS, 8 µL hemolizat eppendorfa eklenir.
2. Recovery düşük için 4 µL 10 µM [13C6]-UDP-Gal, recovery yüksek için 4 µL 200 µM [13C6]- UDP-Gal standardı eklenir. 1dk 16000 g’de santrifüjlenir.
3. 30 dk 37 ˚C’de inkübe edilir. 4. 5 dk kaynar suda bekletilir. 5. 80 µL ACN/su çözeltisi eklenir.
6. 16000 g’de 10 dk santrifüjlendikten sonra supernatant LC-MS/MS’e verilir.
7. Kromatogramda belirlenen alıkonma zamanında [13C6]-UDP-Gal ve İS pik alanları hesaplanır.