Reaktif Oksijen Türlerinin Oluşumu 18

ROS’lar endojen olarak bitkilerin kloroplastlarında fotosentez reaksiyonlarında, plastid ve peroksizomlarda, mitokondrilerdeki sitrik asit döngüsünde, NADPH oksidaz, amino oksidaz, hücre duvarı peroksidazları gibi enzimlerin etkisi ile oluşan en yoğun serbest radikallerdir (Van Camp ve ark., 1998; Van Breusegem ve Dat, 2006).

Radikal olmayan bir atom ya da bir molekülden bir elektron çıkmasıyla veya atom ya da moleküle bir elektron ilavesi ile meydana gelirler. Diğer moleküllerden elektron alabildiklerinden veya onlara elektron verebildiklerinden dolayı organizmada yükseltgeyici veya indirgeyici olarak davranırlar (Halliwell ve Gutteridge, 1998; Flora, 2007).

Bitkisel dokularda, toplam moleküler oksijen tüketiminin yaklaşık % 1-2’si normal koşullarda ROS oluşumuna yol açar. Bu oran bitkiler; tuzluluk, kuraklık, soğuk stresi veya yüksek sıcaklıklar gibi stres koşullarına maruz kaldığında artar. ROS, moleküler oksijenin (O2) indirgenmesiyle meydana gelen bileşikler olup; süperoksit (O2•-), hidroksil radikali (OH•), alkoksil (RO), peroksil (ROO•) gibi bazı serbest radikalleri ile radikal olmayan hidrojen peroksit (H2O2) ve tekli oksijen (1O2) vb. gibi ürünleri içerir (Gill ve Tuteja, 2010; Sandalio ve ark., 2013; Halliwell ve Gutteridge, 2015).

ROS üretimi, çeşitli metabolik süreçlerde kaçınılmaz bir yan ürün olup, optimum büyüme koşulları altında bitkilerde 240 μM s−1O2•− ve 0.5 μM H2O2 gözlemlenebilir. Bununla beraber abiyotik stresler, bitki hücrelerinde stresli hücrelerin 720 µM s−1O2•− ve 5-15 µM H2O2’e kadar birikebilen ROS üretimi gösterebileceği yerlerde çeşitli ROS oluşumunu ve bunların reaksiyon ürünlerinin meydana gelmesini önemli ölçüde artırabilir (Hasanuzzaman ve ark., 2012).

Bitkinin normal gelişim süreci boyunca da sentezlenirler ancak detoksifikasyon mekanizması ile aralarında görülen denge sayesinde zararlı etki oluşturmazlar (Levitt, 1980). Bitkilerde, çevresel stresler sonucunda ROS’lar meydana gelmektedir. Biyotik veya abiyotik stresler altında üretilen ROS’lar, hücrelere zarar veren etmenlerin temel sebebidir (Joseph ve Jini, 2010). Hücrelerde biriken ROS’lar; nükleik asitlerin proteinlerin, klorofillerin, lipidlerin, karbonhidratlar gibi maddelerin oksidasyonuna sebep olmaktadır (Ahmad ve ark., 2010).

Hücrelerde bilinen başlıca ROS’lar; singlet oksijen (1_O

2), süperoksit anyonu (O2•‾), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH•) olup normal şartlarda hücredeki düzeyleri devamlı denge halindedir (Halliwell ve Gutteridge, 1998).

Serbest radikal olan ROS’lar OH•, O2•‾, hidroperoksil (HO2•), peroksil (ROO•), alkoksil (RO•) iken; radikal olmayan ROS’lar tekli oksijen (1O2), H2O2, ozon (O3), hipokloröz asit (HOCl) olarak tanımlanmaktadır. Hemen hemen bütün abiyotik streslerde özellikle de kloroplast, mitokondri ve peroksizomlarda üretilmekte olan bu serbest radikallerle diğer oksidantlar; protein ve klorofilde tahribata, membran lipidlerinde de peroksidasyona sebep olarak hücre zarında hasar meydana getirmektedir. Bu hasar hücrenin ölümüne kadar gidebilmektedir (Tanou ve ark., 2009).

Bir hücre içinde, SOD, ROS’a karşı ilk savunma hattını oluşturur. O2•‾, bir elektron taşıma zincirinin mevcut olduğu herhangi bir yerde üretilir bu yüzden mitokondri, kloroplastlar, mikrozomlar, apoplastlar, peroksizomlar, glioksizomlar ve sitozol dahil olmak üzere hücrenin farklı bölümlerinde O2 aktivasyonu meydana gelebilir (Elstner, 1991). Hücrenin tüm bölümleri O2 oluşumu için olası yerler olsa da; kloroplastlar, mitokondri ve peroksizomların ROS’un en önemli üreticisi olduğu düşünülmektedir (Fridovich, 1986).

2.3.1. Süperoksit (O2•‾) radikali

Abiyotik stres mevcutken bitkinin yaşamsal faaliyetlerinde yavaşlama görülür, su alınımında azalma olur buna bağlı olarakta stomalar kapanır. Bitkinin CO2 alınımında azalma olduğundan, fotosentetik elektronlar yeterli CO2 bulamadığında O2 molekülüne aktarılmakta bunun sonucunda da aktive edilmiş ve toksik etkiye sahip olan süperoksit radikalleri (O2•‾) oluşmaktadır. Fazla miktarda biriken O2•‾, hidroksil radikali OH• ve H2O2 ile birlikte singlet oksijeni (1O2) de içine alan reaktif oksijen türlerini üreterek oksidatif strese, bunun sonucunda da oksidatif hasara sebep olmaktadır (Mittler ve ark., 2004).

Kloroplastta, fotosistem I ve II’de elektron taşıma sisteminde görev alan moleküler oksijenin (O2) bir elektron transferi sonucu indirgenmesi ile kararsız bir yapı olan O2•‾ radikali oluşur (Mehler, 1951b).

ROS ürünleri, oksijenli solunumun sonuçlarından birisidir. Terminal oksidazlar, sitokrom c oksidaz, alternatif oksidazlar O2 ile reaksiyona girdiklerinde dört elektron transfer edilir, su açığa çıkar. Fakat bazen O2, diğer elektron taşıma sistemi (ETS) bileşikleriyle reaksiyona girebilir. Bu durumda yalnızca bir elektron transfer edilir, sonuçta O2•‾ oluşur (Puntarulo ve ark., 1988).

O2•‾ oldukça reaktiftir; yarı ömrü 2-4 μsn kadardır, bu sebeple biyolojik membranları geçmeden hemen H2O2’e SOD ile dismutasyona uğratılır. Ayrıca O2•‾ metal içeren enzimlerdeki Fe+3 ve Cu+2’yi ve kinonları indirgeyerek aktivitelerini ortadan kaldırır. O2•‾’den oluşan hidroperoksil radikalleri (•HO2) de biyolojik membranların sulu fazlarından geçerek, poliansatüre yağ asitlerinden ve lipid hidroperoksitlerden hidrojen atomu çıkarır ve oto-oksidasyona neden olurlar (Halliwell ve Gutteridge, 1998).

O2•‾ radikalleri, kloroplast ETS’lerinin devirsiz yollarındaki elektron transferi sırasında ve diğer hücre organellerinde bulunan O2’nin indirgenmesiyle oluşturulur. O2’nin O2•‾’e indirgenmesi, PSI seviyelerindeki ETS’de görülebilir. O2•‾ üretimi, OH• ve 1O2 gibi ROS’ların daha fazla üretilmesini sağlar ve bu radikaller membran lipidlerinin peroksidasyonu ile hücresel zararlara neden olur (Elstner, 1987).

2.3.2. Hidrojen peroksit (H2O2)

H2O2, süperoksitin çevresinde bulunan moleküllerden bir elektron alması ya da moleküler oksijenin çevresinde bulunan moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H+) ile birleşmesi sonucunda meydana gelir. Biyolojik sistemlerde görülen H2O2’in asıl üretimi, O2•‾ ters değişimi ile gerçekleşmektedir. İki O2•‾ molekülü, süperoksitin ters değişim reaksiyonunda iki proton alarak H2O2 ve O2’i oluştururlar. H2O2, serbest bir radikal olmadığı halde ROS kapsamına girmektedir ve serbest radikal biyokimyasında oldukça önemli bir rol oynar. Çünkü H2O2, Fe+2 ya da diğer geçiş metallerinin varlığında, Fenton reaksiyonu sonucu oluşan O2•‾ varlığında, Haber-Weiss reaksiyonu sonucu, en reaktif ve zarar verici ROS olan OH• radikalini oluşturur (Ahmad ve ark., 2010).

Hidrojen peroksit, aerobik canlılarda süperoksitlerin katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan SOD tarafından katalizlenmesi ile oluşur. H2O2’in oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin nedeni, demir, bakır gibi metal iyonlarının varlığında OH• radikalinin öncülü olarak davranmasıdır. H2O2 özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki reaktif demir formlarını oluşturur. Bu formdaki demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatabilir. Oksitleyici özelliği nedeniyle biyolojik sistemlerde oluşan H2O2’nin derhal ortamdan uzaklaştırılması gerekir (Asada ve ark., 1974).

2.3.3. Hidroksil radikali (OH•)

Hidroksil radikali (OH•) hücrede mevcut olan en reaktif oksidantlardandır. OH•, hücrelerin eliminasyonunda kullanılabilecekleri bir enzim sistemi olmadığından dolayı kolaylıkla tüm biyolojik moleküller ile reaksiyona girebilirler ve fazla miktarda üretildiğinde de hücrelerin ölümüne neden olurlar. Nispeten daha az zararlı olan H2O2 ve O2•ˉ anyonunun metal iyonlarının varlığında Haber–Weiss (Cu+ , Cu+2 Fe+2, Fe+3) ya da fenton (Fe+2 ve diğer geçiş metalleri; Cu, Zn, Mn, Cr, Co, Ni, Mo) reaksiyonu ile oluşur (Fenton, 1894; Fritz ve Joseph, 1934; Smirnoff, 1993).

2.4. Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Üretim Yerleri

2.4.1. Kloroplastlarda ROS oluşumu

Bitkilerde farklı hücre lokasyonlarında görev yapan üç ana ROS üreticisi bölge bulunmaktadır: Bunlar kloroplast ve mitokondrilerde elektron taşıma zincirleri (ETS), bazı peroksidazlar ve oksidazlar (NADPH oksidaz, NADH oksidaz, ksantan oksidaz, lipoksijenaz, gliko oksidaz, amin oksidaz, vb.) ve klorofil molekülleri gibi ışığa duyarlılaştırıcılardır (Dat ve ark., 2000; Blokhina ve ark., 2003).

Işığa dayalı fotosentetik işlemler, kloroplastlarda ROS üretimine ana katkıda bulunan maddelerdir. Kloroplastlardaki rubisco katalizli karboksilaz-oksijenaz reaksiyonları, hem O2 üretimini hem de tüketimini arttırır. Bu nedenle, kloroplastlardaki ETS, O2 bakımından zengin bir ortamda çalışır. Böylece, aşırı yüklü ETS’den elektron sızıntısı kaçınılmaz olarak ROS’u meydana getirecektir. Ayrıca, ışığa duyarlılaştırıcı özelliklere sahip klorofil molekülleri, ışık enerjisinin girilmesinden sonra ROS oluşumuna aracılık eder. ROS seviyesini kloroplastlarda kontrol altında tutmak için, ROS süpürme işlevleri için çeşitli sistemler mevcuttur (Foyer ve ark., 1994; Foyer ve ark., 1994a; Foyer ve Noctor, 2000; Mittler, 2002; Ivanov ve Khorobrykh, 2003). Kloroplastlara ilişkin başlıca ROS üreticileri ve temizleyicileri, Çizelge 2’de şematik olarak sunulmaktadır.

Çizelge 2. Kloroplastlarla ilgili başlıca ROS üreticileri ve temizleyicileri Üreticiler ROS Süpürücüler

Enzimatik Enzimatik Olmayan

PSI’de ETS O2 − SOD Askorbik asit, glutatyon (hidrofilik), karotenoidler, α-

tokoferol (lipofilik) PSII’de ETS H2O2 OH• APX, TdPX - Triplet klorofil 1_O 2 - Fotorespirasyon H2O2a CAT a

Not: APX: askorbat peroksidaz; CAT: katalaz; ETS: elektron taşıma zincirleri; PSI, PSII: fotosistem I, fotosistem II; ROS: reaktif oksijen türleri; SOD: süperoksit dismutaz; TdPX: tioredoksin peroksidaz. a: Peroksizomlarda bulunur.