DNA replikasyonunda çok sayıda polipeptit görev almaktadır. E. coli’de replikasyonda rol alan polipeptitler Tablo 4.1’ de gösterilmektedir.
Tablo 4.1: E. coli ’de DNA replikasyonuna katılan proteinler.
Protein Gen İşlev
DnaA dnaA Başlatıcı protein, primozom oluşumu
DnaB dnaB DNA helikaz
DnaC dnaC DnaB’yi replikasyon kompleksine taşıma
SSB ssb Tek zincirli DNA’ya bağlanma
Primaz dnaG RNA primer sentezi
DNA ligaz lig DNA çentiklerini birleştirme (yapıştırma)
DNA jiraz Süpersarılma
gyrA Çentik kapatma
gyrB ATPaz
DNA pol I polA Primer yıkımı, boşluk doldurma
DNA pol III (holoenzim)
dnaE Polimerizasyon
dnaQ 3’-5’ düzeltme (editing)
Ѳ holE Öz kısımda mevcut
dnaN Kaydırma kıskacı
τa dnaX Kompleksi organize eder; ilerleyen ve gerileyen
DNA pol III’ü birleştirir
γb dnaX Kıskaç yükleyiciye ve SSB proteinine bağlanır
δ holA Kıskaç yükleyici
δ holB Kıskaç yükleyici
χ holC SSB’ye bağlanır
φ holD χ’i kıskaç yükleyicide tutar
a dnaX geninin tam uzunluktaki ürünü
b dnaX geninin translasyonal satır kayma ile oluşturulan daha kısa ürünü
DNA Replikasyonu
22
Prokaryotların hemen tamamı halkasal genoma sahiptirler. Halkasal prokaryotik genomlar teta () modeli denilen bir replikasyon mekanizmasına sahiptirler. Bir model sistem olarak E. coli'nin replikasyon mekanizması incelenebilir. Bu bakteride replikasyo-nun başlayabilmesi için başlatıcı protein denilen bir proteinin bağlanabileceği yaklaşık 245 bp uzunluğunda bir replikasyon orijinine ihtiyaç vardır. Başlatıcı proteinle beraber DNA helikaz da bu bölgeye bağlanarak iki zincirin birbirinden her iki yönde ayrılmasını sağlar (çift yönlü replikasyon). Birbirine ters yöndeki bu iki ayrılma bölgesine replikas-yon çatalı denir. Tek zincir bağlayıcı proteinler bir replikasreplikas-yon çatalındaki ayrılmış zincirleri tek olarak tutar, yani tekrar eşleşmeyi engeller. Her bir zincir yeni sentezlenecek zincir için kalıp görevi görür. Kalıp zincirleri kullanarak onların komplementerini sentez-leyen enzim DNA polimeraz III enzimidir. Ancak DNA polimeraz yeni bir DNA zincirinin sentezini başlatamaz; dNTP'ları 5'P uçlarından uzamakta olan bir zincirin 3'OH uçlarına tek tek bağlayabilir.
Zincirler açıldıktan sonra RNA primaz açılan DNA bölgesine komplementer olan, yaklaşık 10 baz uzunluğunda bir RNA primer sentezler. RNA yapısında olan bu primerin ucunda sağlanan 3'OH uçlarına dNTP'lar tek tek DNA polimeraz III tarafından bağlanır.
Kalıp zincirlerin yönü, yeni zincirin kesintili veya kesintisiz sentezini gerektirir (Şekil 4.1a). Bir replikasyon çatalında 3'-5' kalıp zinciri üzerinden sürekli bir DNA zinciri sen-tezlenir ve sürekli sentezi gerçekleşen bu zincire ilerleyen zincir denir. Ancak 5'-3' kalı-bından kesintili bir şekilde sentezlenmek durumunda olan zincire gerileyen zincir adı verilir. Replikasyon çatalı ilerledikçe yeni primerler sentezlenerek ilerleme yönünün ter-sine doğru parçalar halinde sentez gerçekleştirilir. Bu parçalar bazen Okazaki fragment-leri olarak adlandırılır.
Şekil 4.1: a) Bir replikasyon çatalında meydana gelen olaylar. b) modeli replikasyonun genel akışı.
23
Halkasal kromozomda replikasyon terminasyon bölgesi vardır. Her iki replikas-yon çatalı bu replikasreplikas-yon terminasreplikas-yon bölgesinde birleşir. Ancak bu arada diğer bazı en-zimatik olayların da gerçekleşmesi gerekir. Bunlardan biri yeni sentezlenen zincirde doğ-ruluk kontrolüdür (Şekil 4.1b). Yanlış düzeltme fonksiyonu sentezin hemen arkasından DNA polimeraz III tarafından gerçekleştirilir. Bir diğer enzim DNA polimeraz I yeni zin-cir üzerindeki RNA primerleri uzaklaştırarak yerine DNA nükleotitlerini ekler. Parçalar halindeki yeni zincirin birleştirilmesi DNA ligaz tarafından gerçekleştirilir.
Burada vurgulanması gereken diğer bir konu DNA replikasyonunun hızıdır. E. coli kromozomu yaklaşık 40 dakikada replike edilir. Genom büyüklüğünü yaklaşık 4.1 milyon baz çifti olarak kabul edersek saniyede 2000 bp bir bölgenin replikasyonunun yapılması gerekir. Replikasyonun iki çatalda yürütüldüğünü düşündüğümüzde her bir çatalın hızı-nın 1000 bp/sn olması gerekir. Bu hızlı ve yanlışsız gerçekleştirilmesi gereken sürecin yürütülebilmesi için replikasyon sırasında gerçekleştirilen işlemlerin çok yüksek bir eş-güdüm içinde yürütülmesi gerekir. Gerçekte DNA polimeraz replikasyon çatalındaki olay-ları koordine eden büyük bir nükleoprotein kompleksinin bir parçasıdır. Bu kompleks replizom olarak adlandırılır ve “moleküler makina”ya tipik bir örnektir. Replizomlar rep-likasyonda görev alan enzim ve yardımcı proteinleri kapsar ve replikasyon çatalında mey-dana gelen bütün olayların istenen hızda ve doğrulukta yürümesini sağlar.
Replikasyon Hataları
Türün sabitliğini devam ettirebilmek için DNA replikasyonu hemen hemen hatasız olmalıdır. DNA yapısında meydana gelen ve sonraki nesillere aktarılan değişiklikler mu-tasyon olarak adlandırılır. Nerede meydana geldiğine bağlı olarak bu mumu-tasyonlar genle-rin protein ürünlegenle-rini veya diğer hücresel işlevleri büyük çoğunlukla zarar verici bir şe-kilde değiştirir. Böyle dengesizlikleri önlemek üzere hücre, hata oranlarını azaltıcı meka-nizmalara sahiptir.
DNA replikayonu devam ederken uzamakta olan zincire bazen yanlış bir deoksi-nükleotit eklenebilmektedir. Şekil 4.2’de G’nin karşısına tanlış bir şekilde T’nin yerleştiği görülmektedir. Bazların yanlış bir şekilde eşleştiği bir baz çiftine yanlış eşleşme denir.
Şekil 1.12'deki yanlış eşleşen T sonraki replikasyon sırasında normal olarak A ile eşleşe-cek ve bir GCAT değişimi olacak, sonraki replikasyonlarda bu değişim sonraki bütün kopyalara taşınacaktır.
DNA Replikasyonu
24
Şekil 4.2: Baz eşleşmelerindeki hatalar DNA dizisinde mutasyon denilen değişmelere ne-den olur. Eğer replikasyon sırasında G’nin karşısına yanlışlıkla T yerleştirilirse (A), yavru DNA’da GC baz çifti yerine AT baz çiftinin oluşmasına neden olur (B-D).
Düzeltme (Editing)
Hücrelerin replikasyon sırasındaki hataları düzeltmesinin bir yolu düzeltme (editing) fonksiyonlarıdır. Bu fonksiyon bazı durumlarda farklı tip proteinler tarafından, bazen de DNA polimerazın bileşeni olan proteinler tarafından gerçekleştirilir. Düzeltme proteinleri yeni sentezlenen zinciri geriye doğru kontrol ederek hata varsa belirler ve düzeltir (Şekil 4.3) Eğer uzamakta olan zincire son eklenen nükleotit yanlışsa düzeltme fonksiyonu yan-lış bazın uzaklaştırılmasına kadar replikasyonu durdurur. Sonra replikasyon, doğru baz eklenerek tekrar başlar ve devam eder. DNA zinciri 5’–3’ yönünde uzadığı için son eklenen baz 3’ ucundadır. Dolayısıyla bu nükleotiti uzaklaştıracak enzim aktivitesi 3’-ekzonük-leazdır. Düzeltme proteinleri, yanlış baz eşleşmesini (Şekil 4.2’deki T ile G arasındaki gibi), muhtemelen yanlış eşleşmeden dolayı DNA yapısında oluşan küçük çarpıklığı algı-layarak belirler.
Şekil 4.3: DNA polimerazın düzelte (editing) fonksiyonu. (A) Bir G DNA replike edilirken yanlışlıkla bir A’nın karşısına yerleştirilir. (B-C) Replikasyon yeniden devam etmeden önce G uzaklaştırılıp bir T ile yer değiştirirken, DNA polimeraz durur.
DNA polimeraz I, 3’ eksonükleaz düzeltme aktivitesinin kendisinin bir parçası ol-duğu bir DNA polimerazın örneğidir. Bununla beraber bakteriyel kromozomu replike eden DNA polimeraz III’de düzeltme fonksiyonu, replikasyon sırasında DNA polimerazla beraber ilerleyen, ayrı bir gen tarafından kodlanan bir aksesuvar proteininde yerleşiktir.
E. coli’de 3’ ekzonükleaz düzeltme fonksiyonu dnaQ geni tarafından kodlanır (Tablo 4.1)
25
ve dnaQ mutantları (mutD mutantları) yabani tip hücrelere göre çok daha yüksek kendi-liğinden mutasyon oranları gösterirler. Bu yüksek kendikendi-liğinden mutasyon oranları nede-niyle, E. coli mutD mutantları plazmit ve bakteriyofajlarda rastgele mutasyon oluşturmak amacıyla sıklıkla kullanılır.
RNA primerleri ve düzeltme (editing)
Replikasyon sırasındaki hata sayısını azaltmada düzeltme fonksiyonunun önemi, DNA replikasyonunun neden DNA yapısında değil de RNA yapısında primerler ile başladığını açıklayabilir. Bir DNA zincirinin replikasyonu henüz başladığında, sarmal kısa olacak ve yanlış eşleşmeden dolayı oluşacak yapısal bozukluk, sarmalın kısa olmasından dolayı dü-zeltme fonksiyonu proteinleri tarafından yeterince algılanamayacaktır. Dolayısıyla ilk sentez sırasındaki hatalar düzeltilemeyecektir. Bununla beraber, uzamakta olan zincirin ilk nükleotitlerinin RNA nükleotitleri olması için bir RNA primeri sentezlenir. Yeni sen-tezlenen zincirin 5’ tarafındaki RNA nükleotitleri sentez bir miktar ilerledikten sonra yı-kılır, yıkılan primerin 5’ tarafında yeni sentezlenmiş DNA (sözgelimi 5’ tarafındaki Oka-zaki fragmentinin 3’ ucu) primer olarak kullanılarak RNA primer bölgesi sentezlenebilir.
Bu şartlar altında düzeltme fonksiyonu doğru bir şekilde çalışır durumda olacaktır.
Replikasyon sürecinin verimliliğini koruyan önemli bir diğer sistem, uzayan DNA zincirinin polimerazdan ayrılmasından sonra yanlış eşleşmelerin düzeltilmesinden so-rumludur. E. coli ve en yakın akrabalarında, bu süreç metilasyon ile yönlendirilir ve metil-yönlendirilmiş yanlış eşleşme tamiri olarak adlandırılır. Benzer yanlış eşleşme tamir sistemleri yaşamın her üç domaininde de kullanılır fakat metilasyon sinyalinin kullanıl-ması yaygın değildir.