Pompa imalat süreçleri

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6. Discussão

Dada a importância do proteassoma como constituinte da via de degradação envolvida em diversos processos celulares, o entendimento de seu funcionamento, regulação, bem como a descoberta de alvos inibidores, são de grande relevância para que novos alvos terapêuticos possam vir a serem desenvolvidos (KISSELEV et al., 2012; RUSCHAK et al., 2011). Neste sentido, nosso trabalho objetivou a purificação do proteassoma 20S para avaliação do potencial modulatório de moléculas análogas ao inibidor PR-11, bem como a prospecção de novas moléculas inibitórias obtidas por tripsinólise sérica.

A primeira abordagem consistiu na purificação do proteassoma 20S, iniciada a partir de extrato proteico obtido do homogenato de fígado de camundongo Balb/c, submetido a três etapas cromatográficas, as quais foram baseadas em estudos prévios (BREGUEZ, 2012; CASTRO-BORGES et al., 2007). A etapa inicial consistiu do fracionamento do homogenato em coluna de filtração molecular. O princípio desta técnica baseia-se na separação de moléculas de acordo com a massa molecular. As frações enriquecidas com o proteassoma 20S foram identificadas com base em ensaio de atividade quimotripsina símile monitorado na presença de MG-132 e ativação por SDS.

Agentes caotrópicos como SDS, provavelmente ocasionam o rompimento de interações entre as várias proteínas ligantes do proteassoma, e/ou por meio da desnaturação de extremidades das subunidades α do proteassoma 20S (COUX et al., 1996). Em ambos os casos, o SDS atua facilitando o acesso e a difusão do substrato alvo ao centro catalítico do proteassoma 20S, aumentando consequentemente, as taxas de hidrólise da protease (SHIBATANI; WARD, 1995). A fim de utilizar um padrão de comparação inibitório para o ensaio, foi utilizado o MG-132, inibidor de proteassoma frequentemente escolhido em estudos devido ao fato de ser potente e de baixo custo. Este age inicialmente no sítio com atividade quimotripsina símile, mas em altas concentrações, exerce também efeito inibidor sobre o sítio caspase-símile. Como pode ser observado na Figura 11, foi obtida inibição da atividade quimotripsina símile ao longo de todas as frações avaliadas, o que se deve a presença do grupo funcional aldeído do MG-132, que é altamente reativo e possui elevada afinidade por diversas proteases, exercendo efeito inibitório sobre estas (GOLDBERG, 2012). Porém, ao avaliar em

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conjunto as três condições utilizadas, isto é, a atividade quimotripsina símile na presença de SDS 0,02% que seria ativada, na presença de MG-132 10 µM que seria inibida e a condição controle, observou-se que entre as frações 26 e 34, ocorreu a inibição de cerca de 96% da atividade pelo MG-132, e o aumento da mesma pelo SDS 0,02% quando comparadas a condição controle. Tais resultados indicam claramente a presença de atividade quimotripsina símile do proteassoma na faixa de frações citada.

O intervalo das frações compreendidas na faixa de 26 a 34 obtidas na cromatografia por exclusão molecular foi então submetido ao segundo método de purificação que consistiu no uso da coluna de Hidroxiapatita. A resina utilizada nesta etapa possui grande capacidade de adsorção de proteínas, e os grupos funcionais distribuídos regularmente pela matriz são constituídos de íons cálcio carregados positivamente e grupos fosfatos carregados negativamente (BIO-RAD, 2007). Dessa forma, a resina é capaz de isolar tanto por afinidade de ligação ao cálcio, quanto por meio de troca catiônica quando a interação se dá pelo grupo fosfato. O cálcio possui afinidade pelos grupos carboxila das proteínas e repele os grupos amino, enquanto a troca catiônica ocorre quando estes grupamentos amino de proteínas interagem ionicamente com os fosfatos, ao mesmo tempo em que repelem os grupos carboxilas, por sua vez, a interação grupamento amino-fosfato é interrompida com a adição de sais neutros (CUMMINGS; SNYDER; BRISACK, 2009). Como o proteassoma é uma proteína de caráter ácido e ainda apresenta subunidades capazes de serem modificadas por fosforilação (DREWS, 2007) o mecanismo de ligação de proteassomas a essa coluna provavelmente ocorre a partir de interação por afinidade aos íons cálcio. Dessa forma, são diversos os trabalhos que utilizaram a Hidroxiapatita durante o processo de purificação de proteassomas de diferentes organismos (BECK et al., 2014; CASTRO- BORGES et al., 2007; FRANZETTI et al., 2002; KANAYAMA et al., 1992; MINAMI et al., 2000; NAGY et al., 1998; SAVULESCU et al., 2011).

As frações obtidas ao longo da eluição em Hidroxiapatita foram analisadas por SDS-PAGE a fim de identificar as frações contendo proteassoma 20S e avaliar o grau de enriquecimento obtido até o momento. O perfil obtido após coloração com prata, permitiu a visualização das bandas proteicas condizentes com a massa molecular das subunidades constituintes do proteassoma (Figura 13). Trabalhos que utilizaram diferentes organismos como Schistosoma mansoni (CASTRO-BORGES et al., 2007) e

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Xenopus (SAVULESCU et al., 2011) tendo a Hidroxiapatita como método de

enriquecimento do proteassoma 20S, apresentaram perfis de bandas proteicas condizentes com o perfil obtido neste trabalho.

Com o intuito de obter uma fração mais homogênea de proteassomas 20S optou- se por realizar uma recromatografia em exclusão molecular. Ao final da purificação, ensaios de atividade quimotripsina símile das frações contendo proteassoma 20S foram realizados para determinação de atividade específica e grau de enriquecimento obtido em cada etapa. A recromatografia por exclusão molecular foi satisfatória, uma vez que se obteve aumento da atividade específica após este procedimento. Além disso, foram obtidos dois perfis distintos de proteassoma 20S, um diferindo do outro pela presença de bandas proteicas de alta massa molecular no perfil eletroforético 1D (Figura 14). Considerando que estas proteínas se mantiveram presentes até o momento final da purificação, uma hipótese levantada durante o estudo, seria a possível interação destas moléculas e sua relação como moduladoras alostéricas do proteassoma. Assim como as modificações pós traducionais e complexos moduladores, diversas proteínas associam- se ao proteassoma a fim de regular sua atividade (WANG; HUANG, 2008). Tais proteínas podem influenciar no processo de reconhecimento de substratos poliubiquitinados, desubiquitinação e desnaturação de substratos alvos (SCRUGGS et al., 2012). Dessa forma, utilizou-se de espectrometria de massas para identificação das proteínas presentes na amostra.

Durante a eluição dos peptídeos gerados pela digestão das frações contendo atividade quimitripsina símile do proteassoma 20S em espectrômetro de massas, obteve- se uma distribuição uniforme dos peptídeos ao longo do gradiente, o que possibilitou uma identificação mais eficaz. A identificação de íons de série y e b, cujos fragmentos são referentes ao rompimento de ligações peptídicas, é um importante dado, uma vez que a confirmação destes íons se dá por complementariedade. Todas as proteínas identificadas (Tabelas 4 e 5) apresentaram homologia com aquelas presentes em banco de dados de Mus musculus, o qual foi utilizado para busca.

Dentre as identificações, obteve-se a presença de HSPs (Heat shock proteins), proteínas estas, já conhecidas por se ligarem ao proteassoma exercendo efeito modulatório sob sua atividade proteolítica (BOZAYKUT; OZER; KARADEMIR, 2014; LANNEAU et al., 2010). As HSPs são chaperonas moleculares, encontradas em todas

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as células e classificadas normalmente de acordo com a massa molecular. São consideradas fatores de estresse e são rapidamente induzidas em resposta a fatores diversos como aumento de temperatura, drogas citotóxicas, irradiação UV e metabolismo celular. Possuem ainda importante papel na conformação e maturação de vários fatores de transcrição e proteínas. No caso das HSP 70 e HSP 90, quando ocorre a presença de uma proteína mal enovelada ou com perda da função, estas são responsáveis por determinar se as mesmas serão reparadas ou degradadas pelo sistema ubiquitina proteassoma. Dessa forma, quando o re-enovelamento não é mais possível, os substratos são direcionados para a degradação, contudo, frente a inibição da atividade proteassomal, um aumento na expressão das HSPs é ocasionado, uma vez que há necessidade na prevenção do acúmulo de agregados proteicos e proteínas danificadas (BOZAYKUT et al., 2014). Assim, a associação direta ou indireta dessas HSPs com o proteassoma para garantir o controle de qualidade das proteínas é importante mecanismo celular (LANNEAU et al., 2010). Em diversos trabalhos que objetivaram a purificação do proteassoma 20S utilizando-se de exclusão molecular, foram encontradas HSPs co-eluídas junto ao complexo (BOUSQUET-DUBOUCH et al., 2009; CASTRO- BORGES et al., 2007; KAUTTO et al., 2009; MONTEL et al., 1999).

Dentre as demais proteínas co-eluídas com o proteassoma, foram identificadas proteínas alvos de degradação pela via proteassomal, como a subunidade α da Hemoglobina, Glutamina Sintetase, Tropomiosina, Enzima Alcool Desidrogenase (ADH), Betaína-homocisteína S-metil Transferase e 3-Cetoacil-CoA Tiolase. KAUTTO et al. (2009), realizaram a purificação de proteassomas 26S de Trichoderma

resei por meio de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular e identificou por

espectrometria de massas, proteínas co-eluídas como a Actina, Fatores de Iniciação α3 e α4, Fatores de Elongação γ1 e HSPs. BOUSQUET-DUBOUCH et al. (2009), demonstraram por espectrometria de massas 322 proteínas associadas ao proteassoma de camundongos que recebiam álcool cronicamente, enquanto nos animais controles, foram encontradas 495. Dentre elas, a Carbamoil Fosfato Sintetase, Tubulinas, Fatores de Elongação, Miosina, Citocromo P450, HSPs, Tropomiosina, entre outras. No presente trabalho para a maioria das proteínas identificadas, não há relatos na literatura de possíveis interações com o proteassoma. Entretanto, não se descarta a possibilidade

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dessas moléculas representarem novos ligantes do proteassoma 20S, com possível capacidade moduladora de atividade.

A inibição do proteassoma tem sido considerada ferramenta promissora na biologia celular em estudos que visam elucidar as funções celulares diversas. Vale ressaltar a busca para o desenvolvimento de peptídeos inibidores como agentes antitumorais após o emprego do Bortezomib para o tratamento do mieloma múltiplo. Atendendo a um dos objetivos específicos do trabalho, avaliou-se a capacidade inibitória de análogos do peptídeo PR-11. Esse peptídeo liga-se a subunidade α7, alterando a conformação do proteassoma, e consequentemente, inibindo sua atividade e modificando dessa forma a expressão de fatores da via do NFκβ, o que faz com que lesões sejam reduzidas em estados inflamatórios (ANBANANDAM et al., 2008).

Em estudos que utilizaram PR-39 e sequências parciais do PR-11, como o PR-8 e PR-5, a fim de definir a região envolvida na interação com o proteassoma foi observado grande efeito inibitório por parte dos peptídeos PR-39 e PR-11, ao contrário dos peptídeos menores, que exerceram pouco efeito, presumindo-se que estes atuaram como substratos do proteassoma. Além disso, foi observado que análogos com modificações na região N-terminal, não exerceram atividade inibitória sobre o proteassoma 20S (GACZYNSKA et al., 2003). Sabendo da sequência responsável pela modulação da atividade proteassomal, tornou-se de interesse a busca por estruturas análogas que pudessem interferir com a mesma em proporções diversas para uso de acordo com o interesse e necessidade.

Em trabalho prévio realizado pelo grupo de pesquisa (BREGUEZ, 2012), foram sintetizados diversos peptídeos análogos ao PR-11, os quais sofreram modificações em sua região C-terminal, uma vez, que a região N-terminal é a de maior influência sobre a atividade proteolítica do proteassoma (ANBANANDAM et al., 2008). Dando continuidade a investigação sobre os análogos em diferentes concentrações, foram selecionados três peptídeos os quais foram empregados no estudo. A escolha dos análogos foi baseada na semelhança estrutural entre ambos, uma vez que nestes três peptídeos, as modificações consistiam na introdução de um resíduo de Fenilalanina (F) ao final da cadeia, sendo que em dois deles, G9F12 e I9F12, foram realizadas substituições de um resíduo de Leucina por Glicina (G) e Isoleucina (I) respectivamente na posição 9. Ambos os peptídeos obtiveram um grau de pureza satisfatório ao final da

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síntese e tiveram suas identidades confirmadas por espectrometria de massas. Estes peptídeos foram analisados previamente quanto à capacidade inibitória na concentração de 1 µM frente à atividade quimotripsina símile de preparações enriquecidas de proteassoma 20S humano, murino e de vermes adultos de Schistosoma mansoni. As capacidades inibitórias de todos os peptídeos foram similares à do PR-11 e não apresentaram diferenças significativas (BREGUEZ, 2012).

Ao avaliar o potencial inibitório nas diferentes concentrações estabelecidas (Figura 18), observa-se que as taxas de inibição dos peptídeos modificados são semelhantes às obtidas para o peptídeo PR-11, exceto pelo fato de os peptídeos F12 e G9F12 apresentarem um potencial inibitório maior que o PR-11. Esse resultado motivou novos testes de cinética de inibição para F12 e G9F12 em concentrações menores. Nessa segunda análise, notou-se que o F12 apresentou menor IC50 que o PR-11, o que

se refere que a quantidade de F12 necessária para inibir 50% da atividade proteassomal é menor que a quantidade de PR-11 necessária, sendo assim, a capacidade de inibição do F12 foi maior que a capacidade do PR-11, apresentado diferenças significativas nas concentrações de 0,25 e 0,125 µM (p<0,05). Para os demais, não houve diferenças significativas, o que mostra que tais análogos possuem potencial inibitório semelhante ao PR-11.

Na literatura, são descritos análogos do PR-11 como G9 (RRRPRPPYGPR), W12 (RRRPRPPYLPRW) e F8W12 (RRRPRPPFLPRW), os quais representam moléculas de maior capacidade inibitória quando comparada ao PR-11. Tais estruturas consistiram em modificações sutis, onde foram mantidas as regiões identificadas como requisito para inibição do proteassoma por meio da interação com a subunidade α7, ou seja, foram mantidos pelo menos dois resíduos de arginina carregados positivamente na região N-terminal e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal. ANBANANDAM et al. (2008) avaliaram ainda estruturas com modificações na região N-terminal de forma não conservativa ao PR-11, onde observaram que não houve inibição da atividade proteassomal, porém quando a modificação foi realizada de forma conservativa os resultados foram satisfatórios. Outras modificações testadas, consistiram na substituição de Tirosina na posição 8, a qual possui importantes características na conformação do PR-11 devido a sua hidrofobicidade e presença de anel aromático. Este resíduo foi

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substituído por Fenilalanina e Glutamina, onde ambos demonstraram aumento na capacidade inibitória(ANBANANDAM et al., 2008; GAO et al., 2000).

Além dos análogos de PR-11 são encontrados na literatura, peptídeos ricos em prolina, o que reforça a importância do estudo de moléculas análogas de inibidores, uma vez que apresentam como domínio ativo a região rica em prolina. As estruturas análogas ao PR-11 assemelham-se a estrutura do inibidor endógeno PI 31, devido a presença de prolinas na porção C-terminal. Este age como inibidor seletivo do proteassoma impedindo a ligação do complexo heptamérico PA28 αβ ao centro catalítico, também por meio da interação com subunidades α do proteassoma. No caso do PI 31, foi demostrado por meio de modificações, que a porção rica em prolina presente na região C-terminal, define a atividade da molécula (MCCUTCHEN-MALONEY et al., 2000). Estes trabalhos mostram a relevância na busca de estruturas análogas, com pequenas modificações em sua cadeia, uma vez que estas podem vir a apresentar potenciais de inibição e regulação distintos.

Outra estratégia utilizada para a prospecção de novas moléculas inibidoras consistiu na busca de peptídeos trípticos com capacidade de modulação da atividade proteassomal. A maioria dos inibidores de proteassoma consiste de peptídeos curtos modificados com grupo eletrofílico, que interagem com o C-terminal de resíduos treonina catalíticos dessa protease. Como exposto anteriormente, os peptídeos inibidores de proteassoma distinguem-se em diversas classes, sendo os mais comumente utilizados os peptídeos aldeídicos, boronatos e epoxicetonas (DOWNEY et al., 2015; GOLDBERG, 2012).

A fim de se obter uma variedade de peptídeos a serem testados frente a atividade do proteassoma, utilizamos a tripsinólise de proteínas de soro fetal bovino, com base na complexidade proteica que estaria disponível para originar diversidade estrutural de peptídeos. Além disso, a digestão por meio de tripsina possibilitou a obtenção de peptídeos com tamanho médio similar aos inibidores de proteassoma já conhecidos. Entretanto, ao se utilizar o soro como fonte de proteínas, uma maior concentração de peptídeos provenientes de proteínas presentes em maior abundância seriam gerados, o que poderia dificultar possíveis interações de peptídeos presentes em baixos níveis com o proteassoma 20S. Com o intuito de garantir homogeneidade de proteínas presentes na

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amostra, optou-se pela utilização da técnica de depleção para uma melhor representatividade do proteoma total sérico, anteriormente à etapa de tripsinólise.

A utilização de uma biblioteca combinatorial de hexapeptídeos propiciou com que cada proteína sérica se ligasse a um hexapeptídeo específico até a saturação dos sítios ligantes. Desse modo, as proteínas abundantes foram removidas, enquanto que as proteínas de baixa abundância foram concentradas, possibilitando assim, um equilíbrio entre a diversidade proteica contida na amostra. Nota-se que após a depleção, proteínas abundantes do soro como albumina apresentaram níveis reduzidos enquanto outras de menor massa molecular apareceram evidentes no gel 1D (Figura 19), o que demonstra a eficácia da técnica, uma vez que foi obtido com a mesma, a depleção de algumas proteínas e consequente enriquecimento de outras.

Após a depleção de proteínas abundantes e enriquecimento de proteínas com menor massa, foram gerados os peptídeos trípticos e ensaios de atividade foram realizados nas concentrações estabelecidas, seguindo protocolos descritos anteriormente. A análise dos resultados obtidos (Figura 20), mostra que ocorreu inibição da atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S nas concentrações de 50 e 6,25 µM de peptídeos totais. Atividade inibitória com diferença significativa ocorreu a partir de 120 minutos de hidrólise do peptídeo fluorogênico utilizando-se de peptídeos totais na concentração de 50 µM (p<0,05). Acredita-se que efeitos diversos dose dependente possam ocorrer, uma vez que peptídeos diferentes podem se ligar a sítios múltiplos no proteassoma 20S.

Dentre várias classes de peptídeos estudados, são diversos os mecanismos de ação e as concentrações com capacidade inibitória. O inibidor específico de imunoproteassoma IPSI-001, por exemplo, se liga preferencialmente as subunidades β1i. Essa molécula induziu acúmulo de conjugados ubiquitina-proteína, proteínas pró- apoptóticas, ocasionando apoptose celular em modelos de cânceres hematológicos (KUHN et al., 2009). Os peptídeos do tipo aldeídico realizam uma ligação lenta ao sítio catalítico e além disso, a dissociação pode se dar de forma rápida por oxidações, o que resulta em inibição de curta duração e possível resistência, porém sua vantagem, é o fato de serem de fácil penetração celular. Já os peptídeos boronatos são mais potentes e seletivos que os aldeídicos, e embora sejam reversíveis, o rompimento da ligação pode levar horas e apresentam a vantagem de não serem inativados por oxidações e nem

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serem transportados para fora das células (PELLOM; SHANKER, 2012). Derivados de TMC-95, peptídeo cíclico de Apiospora montagne, é um inibidor potente da atividade quimotripsína símile, que age de forma competitiva. As epoxicetonas são peptídeos que possuem alta afinidade pelo proteassoma, em consequência à formação do derivado morfolina durante o processo de inibição (KISSELEV; GOLDBERG, 2001).

A última análise consistiu na identificação de possíveis peptídeos ligantes ao proteassoma, incubando-se o mesmo com os peptídeos trípticos obtidos por digestão de amostra sérica depletada. Após a remoção dos peptídeos não ligantes por sucessivas lavagens, realizou-se alteração de pH para a recuperação dos peptídeos com capacidade de se ligar ao proteassoma 20S. Os peptídeos eluídos foram então submetidos à análise por espectrometria de massas. Os resultados obtidos para essa análise não foram conclusivos uma vez que os peptídeos trípticos ligantes do proteassoma 20S podem estar presentes em baixíssimas concentrações. Mesmo considerando-se a alta sensibilidade do analisador de massas utilizado, outros interferentes presentes na preparação podem ainda ter dificultado a identificação dos peptídeos. Métodos alternativos de ensaios de ligação ao proteassoma e recuperação dos ligantes serão futuramente padronizados no laboratório.