PCR ile hedef gen bölgelerinin çoğaltılması

PCR amplifikasyon mastermiks protokolü; 32 pl Distile su, 5 pl 10X

MgCh’süz PCR buffer, 2 pl MgCh (25 mM), 4 pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer R-F

(20 pmol), 0,2 pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl) ve 5 pl DNAolmak üzere toplamda

final konsantrasyonu 50 pl olacak şekille hazırlanmıştır.

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Valenzuela ve ark. (40) tarafından tanımlanan,

501 bç'lik ürün oluşturan, OXA-23-F GATGTGTCATAGTATTCGTCG, OXA-

23-R TCACAACAACTAAAAGCACTG primerleri amplifikasyon işlemi için

kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak şekilde; 5 pl 10X MgCl2’süz PCR

buffer, 2 pl MgCl2 (25 mM), 4pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2

pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA, 32 pl distile su PCR tüplerine

dağıtılıp, termal cycler cihazına konulmuştur (2720 Thermal cycler Applied

Biosystems). Cihaz 94°C’de 2 dakika ilk denatürasyonun ardından, 94°C’de 1

dakika denatürasyon, primer için bağlanma ısısı 56°C’de 1 dakika ve 72°C’de 1

dakika uzama ile toplam 36 siklus ve final uzama olarak 72°C’de 15 dakika

olacak şekilde ayarlanarak amplifikasyon yapılmıştır. Amplifikasyon sonrası

blaoxA -23 gen bölgesi belirlemek amacı ile %2’lik agaroz jel hazırlanarak jel

elektroforezi uygulanmıştır.

2. blaOXA-24 gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Valenzuela ve ark. (40) tarafından tanımlanan,

246 bç'lik ürün oluşturan OXA-24-F TTCCCCTAACATGAATTTGT, OXA-24-

R GTACTAATCAAAGTTGTGAA primerleri amplifikasyon işlemi için

kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak şekilde; 5 pl 10X MgCl2’süz PCR

buffer, 2 pl MgCl2 (25 mM), 4 pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2

pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA, 32 pl distile su PCR tüplerine

dağıtılıp, termal cycler cihazına (2720 Thermal cycler Applied Biosystems)

dakika denatürasyon, primer için bağlanma ısısı 52°C 1 dakika ve 72°C’de 1

dakika uzama ile toplam 36 siklus ve final uzama olarak 72°C’de 15 dakika

olacak şekilde ayarlanarak amplifikasyon yapılmıştır. Amplifıkasyon sonrası

blaoxA-24 gen bölgesinin varlığının belirlenmesi amacı ile %2’lik agaroz jel

elektroforezi uygulanmıştır.

3. blaOXA-51 gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Turton ve arkadaşları (41) tarafından

tanımlanan, 353 bç'lik ürün oluşturan OXA-51-F

TAATGCTTTGATCGGCCTTG, OXA-51-R TGGATT GCACTTCATCTTGG

primerleri amplifikasyon işlemi için kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak

şekilde; 5 pl 10X MgCh’süz PCR buffer, 2 pl MgCh (25 mM), 4 pl dNTP (2

mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2 pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA,

32 pl distile su PCR tüplerine dağıtılıp, termal cycler cihazına (2720 Thermal

cycler Applied Biosystems) konulmuştur. Cihaz 94°C’de 2 dakika ilk

denatürasyonun ardından, 94°C’de 1 dakika denatürasyon, primer için bağlanma

ısısı 56°C 1 dakika ve 72°C’de 1 dakika uzama ile toplam 36 siklus ve final

uzama olarak 72°C’de 15 dakika olacak şekilde ayarlanarak amplifikasyon

yapılmıştır. Amplifıkasyon sonrası blaOXA-51 gen bölgesinin varlığının belirlenmesi

amacı ile %2’lik agaroz jel elektroforezi uygulanmıştır.

4. blaOXA-58 gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Andrea ve arkadaşlar (43) tarafından

GCTGAGCATAGTATGAGTCG, OXA-58-R AAGCAAATGCCACCACTTGC

primerleri amplifikasyon işlemi için kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak

şekilde; 5 pl 10X MgCh’süz PCR buffer, 2 pl MgCİ2 (25 mM), 4 pl dNTP (2

mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2 pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA,

32 pl distile su PCR tüplerine dağıtılıp, termal cycler cihazına (2720 Thermal

cycler Applied Biosystems) konulmuştur. Cihaz 94°C’de 2 dakika ilk

denatürasyonun ardından, 94°C’de 1 dakika denatürasyon, primer için bağlanma

ısısı 58°C 1 dakika ve 72°C’de 1 dakika uzama ile toplam 36 siklus ve final

uzama olarak 72°C’de 15 dakika olacak şekilde ayarlanarak amplifikasyon

yapılmıştır. Amplifikasyon sonrası blaOXA-58 gen bölgesinin varlığının belirlenmesi

amacı ile %2’lik agaroz jel elektroforezi uygulanmıştır.

5. blaKpc gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Monteiro ve ark. (42) tarafından tanımlanan,

785 bç'lik ürün oluşturan KPC-F TCGCTAAACTCGAACAGG, KPC-R

TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC primerleri amplifikasyon işlemi için

kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak şekilde; 5 pl 10X MgCl2’süz PCR

buffer, 2 pl MgCl2 (25 mM ), 4 pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2

pl Taq DNA Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA, 32 pl distile su PCR tüplerine

dağıtılıp, termal cycler cihazına (2720 Thermal cycler Applied Biosystems)

konulmuştur. Cihaz 94°C’de 2 dakika ilk denatürasyonun ardından, 94°C’de 1

dakika denatürasyon, primer için bağlanma ısısı 56°C 1 dakika ve 72°C’de 1

dakika uzama ile toplam 36 siklus ve final uzama olarak 72°C’de 15 dakika

blaKPC gen bölgesinin varlığının belirlenmesi amacı ile %2’lik agaroz jel elektroforezi uygulanmıştır.

6. blaIMp gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Monteiro ve ark. (42) tarafından tanımlanan,

120 bç'lik ürün oluşturan, IMP-F GAGTGGCTTAATTCTCRATC ve IMP-R

AACTAYCCAATAYRTAAC primerleri amplifikasyon işlemi için kullanılmıştır.

Toplam karışım 50 pl olacak şekilde; 5 ^1 10X MgCl2’süz PCR buffer, 2 ^1

MgCl2 (25 mM), 4 pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2 pl Taq DNA

Polimeraz (5U/pl), 5 pl DNA, 32 pl distile su PCR tüplerine dağıtılıp, termal

cycler cihazına (2720 Thermal cycler Applied Biosystems) konulmuştur. Cihaz

94°C’de 2 dakika ilk denatürasyonun ardından, 94°C’de 1 dakika denatürasyon,

primer için bağlanma ısısı 56°C 1 dakika ve 72°C’ de 1 dakika uzama ile toplam

36 siklus ve final uzama olarak 72°C’de 15 dakika olacak şekilde ayarlanarak

amplifikasyon yapılmıştır. Amplifıkasyon sonrası blaIMP gen bölgesinin varlığının

belirlenmesi amacı ile agaroz %2’lik jel elektroforezi uygulanmıştır.

7. blaVIM gen bölgesinin amplifikasyonu:

Klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa ve A. baumannii suşlarından

elde edilen ekstraksiyon ürünleri, Monteiro ve ark. (42) tarafından tanımlanan,

382 bç'lik ürün oluşturan VIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC, VIM-R

AATGCGCAGCACCAGGATAG primerleri amplifikasyon işlemi için

kullanılmıştır. Toplam karışım 50 pl olacak şekilde; 5 pl 10X MgCl2’süz PCR

buffer, 2 pl MgCl2 (25 mM ), 4 pl dNTP (2 mM), 2 pl Primer F-R (20 pmol), 0,2

termal cycler cihazına (2720 Thermal cycler Applied Biosystems) konulmuştur.

Cihaz 94°C’de 2 dakika ilk denatürasyonun ardından, 94°C’de 1 dakika

denatürasyon, primer için bağlanma ısısı 58°C 1 dakika ve 72°C’de 1 dakika

uzama ile toplam 36 siklus ve final uzama olarak 72°C’de 15 dakika olacak

şekilde ayarlanarak amplifikasyon yapılmıştır. Amplifıkasyon sonrası blayIM gen

bölgesinin varlığının belirlenmesi amacı ile %2’lik agaroz jel elektroforezi

uygulanmıştır.