4. BULGULAR
4.9. PC3-P ve PC3-R Hücrelerinde Senesensin Araştırılması
Senesensi tespit, takip ve ölçmek için birden fazla marker kullanmak gerekmektedir. Senesent hücreleri en az 3 senesens ilişkili özelliği inceleyerek belirlemek tavsiye edilmektedir (González-Gualda ve ark., 2021). Bu doğrultuda senesensi tespit etmek için 1. β-galaktosidaz aktivitesinin pH 6.0’da belirlenmesi, 2.
hücre döngüsü progresyonunu belirlemek için bir CDK inhibitörü olan p16 INK4a proteinin Western blot ile incelenmesi ve 3. SASP fenotipi faktörlerinin ekspresyonlarının Sitokin Array ile ve SASP faktörlerinden biri olan MMP-1’in Western blot ile belirlenmesi yöntemleri kullanılmıştır.
Protein Accession
No Peptide
count Unique
peptides Confidence
score M.W.
(Dalton) Kat değişimi (muamele/kontrol) Heat shock 70
kDa protein 1A P0DMV8 25 18 200.8 70337 15.5
Heat shock cognate 71 kDa protein
P11142 22 17 168 71126 1.16
97
SA-β-Gal (Senescence-associated β-galactosidase) aktivitesinin belirlenmesi en çok kullanılan senesens markerlerinden veya assay’lerinden birdir. SA-β-Gal bir hidrolaz enzimidir ve β-galaktosidleri monosakkaritlere parçalamaktadır. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) SA-β-Gal aktivitesi için kullanılan en yaygın substrattır. X-Gal, SA-β-Gal tarafından galaktoza ve 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole-1’e katalize edilir ve bunlar daha sonra dimerleşerek mavi renkli çökelti oluşturur. X-Gal substratı kullanılarak yapılan bu enzimatik assay ile senesent hücrelerde lizozomal proteinlerin artan ekspresyon ve aktiviteleri gözlenmektedir.
Birçok hücre endojen olarak pH 4.0’te aktif β-galaktosidaz üretirler. Senesent hücreleri normal hücrelerden ayırmak için bu sebeple enzim için optimal olmayan bir pH’da (pH 6.0) aktivite ölçülmektedir. Şekil 26’da görüleceği üzere PC3-P ve PC3-R hücrelerinde 48 saat boyunca, 10 nM ve 100 nM bortezomib konsantrasyonları uygulamasından sonra Senescence β-Galactosidase Staining Kit‘i ile SA-β-Gal aktivitesi araştırılmıştır. PC3-P hücrelerinde artan bortezomib konsantrasyonlarına göre SA-β-Gal aktivitesini ifade eden mavi renkli çökeltiler azalmıştır. PC3-P hücrelerinde kontrol grubundaki mavi renk veren hücrelerin sayısı 10 nM ve özellikle de 100 nM bortezomib ile 48 saat muamele edilen hücrelerden daha çoktur. 100 nM ilaç uygulamasında hücre sayısı da azalmıştır fakat genel olarak ortaya çıkan mavi renk ile boyanmış hücrelerin sayısı az bulunmuştur. Diğer yandan yine Şekil 26’da görüleceği gibi, PC3-R hücrelerinde kontrol grubundaki hücrelerde SA-β-Gal aktivitesi PC3-P hücrelerinin kontrol grubundan oldukça azdır.
PC3-R hücrelerinde (Şekil 26) 10 nM ve 100 nM bortezomib ile muamele edilen hücre gruplarında görülen SA-β-Gal aktivitesi kendi kontrol grupları ile oldukça benzerdir ve aktivitede gözle görülebilen bir artış meydana gelmemiştir. PC3-P ve PC3-R hücrelerindeki aynı konsantrasyondaki ilaç muamele grupları karşılaştırıldığında PC3-P hücrelerindeki SA-β-Gal aktivetesinin daha çok olduğu ya da PC3-R hücrelerindeki SA-β-Gal aktivitesinin PC3-P hücrelerinden daha az olduğu gözükmektedir (Şekil 27). SA-β-Gal aktivitesinin ölçülmesinden elde edilen sonuçlar, PC3-R hücrelerinde senasansın dirençli olamayan PC3-P hücrelerinden daha az olduğunu ve ilginç olarak bortezomib’in senesensi önleyebileceği fikrini ortaya koymaktadır.
98
Şekil 26. β galaktosidaz aktivitesini pH 6’da kolorimetrik yöntem ile belirlenmesi. Deney gruplarını kontrol (izotonik su), 10 nM ve 100 nM bortezomib ilaç muamelesi oluşturmaktadır. Hücreler bortezomib ile 48 saat muamele edilmiştir. Fotoğraflar, inverted mikroskop altında 200X büyütme ile çekilmiştir.
PC3-P PC3-R
Con
10 nM
100 nM
99
Şekil 27. β galaktosidaz aktivitesi gösteren hücrelerin hesaplanması. Deney gruplarını kontrol (izotonik su), 10 nM ve 100 nM bortezomib ilaç muamelesi oluşmaktadır. Muamele süresi 48 saattir. Hesaplama her bir grupta bulunan mavi renk veren hücrelerin toplamının gruptaki toplam hücrelerin sayısı ile oranlayarak yapılmıştır.
Yukarıda bahsedildiği üzere senesensi araştırmak için kullandığımız diğer yöntemler arasında hücre döngüsü progresyonunu belirlemek için bir CDK inhibitörü olan p16 INK4a proteinin ve SASP faktörlerinden biri olan MMP-1’in Western blot ile incelenmesidir. Bu sebeple, p16 INK4a ve MMP-1 ekspresyon seviyelerine PC3-P ve PC3-R hücrelerinde, 24 ve 48 saat boyunca 10 nM ve 100 nM bortezomib muamelesinden sonra bakılmıştır. Şekil 28A; kontrol hücrelerinde, 10 nM ve 100 nM bortezomib konsantrasyonları ile 24 saat muamele edildikten sonra, PC3-P ve PC3-R hücrelerinde meydana gelen p16 INK4a proteinindeki ekspresyon değişikliklerini gösteren, Western blot görüntüsüdür.
Şekil 28B’de bantların hesaplanmasında görüleceği gibi PC3-P hücrelerindeki 10 nM ve 100 nM bortezomib muamelelerindeki p16 INK4a proteinindeki ekspresyon düzeylerinde, kontrol grubuna göre azalma vardır. Diğer yandan PC3-R hücrelerine bakıldığında 10 nM bortezomib muamelesinde p16 INK4a ekspresyonunda biraz artma gözlenirken 100 nM bortezomib muamelesindeki p16 INK4a seviyeleri kontrol grubu ile hemen hemen aynıdır. PC3-P ve PC3-R hücrelerinin kontrol grupları karşılaştırıldığında, ilaç uygulanmayan normal şartlarda p16 INK4a ekspresyonunun PC3-P hücrelerinde daha fazla olduğu gözükmektedir.
PC3-P Co n
PC3-P 10 n M
PC3-P 100 nM PC3-R Co
n
PC3-R 10 n M
PC3-R 100 nM 0
5 10 15
p<0.001 p<0.05
Treatment
SA-β-gal (%)
100
Bu deneyde elde edilen sonuçlar, bortezomib’in PC3-P hücrelerinde p16 INK4a ekspresyonunu azalttığını ve PC3-R hücrelerinde p16 INK4a ekspresyonunun daha az olduğunu ve bortezomib muamelesinde p16 INK4a ekspresyonunda önemli bir değişiklik meydana gelmediğini göstermektedir.
Şekil 28. A) PC3-P ve PC3-R prostat hücre hatlarında, 24 saat ilaç muamelesinden sonra p16 INK4a proteinin Western blot görüntüsü. 35 µg protein %12’lik SDS-PAGE’de ayrıştırılmıştır. Western blot, p16 INK4a formlarını tanıyantavşan monoklonal anti-p16 INK4a antikorları ile yapılmıştır. Yükleme kontrolleri, tavşan poliklonal anti β-aktin antikoru ile yapılmıştır. Tüm primer antikorlar için sekonder antikor olarak, HRP ile konjuge edilmiş anti-tavşan antikoru kullanılmıştır. Her iki hücre hattı 24 saat boyunca 10 nM ve 100 nM bortezomib ile muamele edilmiştir, kontrol hücresi izotonik su ile muamele edilmiştir. B) p16 INK4a seviyelerinin β-aktin seviyeleri ile normalize edildikten sonraki hesaplanması.
Şekil 29A; kontrol hücrelerinde, 10 nM ve 100 nM bortezomib konsantrasyonları ile 24 saat muamele edildikten sonra PC3-P ve PC3-R hücrelerinde meydana gelen MMP-1 proteinindeki ekspresyon değişikliklerini gösteren Western blot görüntüsüdür. Şekil 29B’de bantların hesaplanmasında görüleceği gibi PC3-P hücrelerindeki 10 nM ve 100 nM bortezomib muamelelerindeki MMP-1 proteinindeki ekspresyon düzeylerinde, kontrol grubuna göre önemli bir azalma vardır. PC3-R hücrelerine bakıldığında 100 nM bortezomib muamelesinde MMP-1 proteinindeki ekspresyon seviyesi azalmıştır. PC3-P hücrelerinde meydana gelen ekspresyondaki azalmalar PC3-R hücrelerinkinden daha fazladır.
PC3-P Co n PC3-P 10 n
M PC3-P 100 nM
PC3-R Co n PC3-R 10 n
M PC3-R 100 nM 0.00
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
Treatment
p16 INK4a/β-actin
A
B
101
PC3-P ve PC3-R hücrelerinde, kontrol gruplarında, MMP-1 proteinin bazal seviyelerinin PC3-P hücrelerinde, PC3-R hücrelerine göre daha fazla eksprese olduğu gözükmektedir. MMP-1 proteini bahsedildiği üzere senesent hücrelerdeki SASP fenotipinde salgısı artan bir proteindir. 24 saatlik bortezomib uygulamalarının bu proteinin ekspresyon seviyelerinde bir azalma meydana getirdiğini ve en çok da PC3-P hücrelerinde bir azalmanın olduğunu göstermektedir.
Şekil 29. A) PC3-P ve PC3-R prostat hücre hatlarında, 24 saat ilaç muamelesinden sonra MMP-1 proteinin Western blot görüntüsü. 35 µg protein %12’lik SDS-PAGE’de ayrıştırılmıştır. Western blot, MMP-1 formlarını tanıyan tavşan monoklonal anti-MMP-1 antikorları ile yapılmıştır. Yükleme kontrolleri, tavşan poliklonal anti β-aktin antikoru ile yapılmıştır. Tüm primer antikorlar için sekonder antikor olarak, HRP ile konjuge edilmiş anti-tavşan antikoru kullanılmıştır. Her iki hücre hattı 24 saat boyunca 10 nM ve 100 nM bortezomib ile muamele edilmiştir, kontrol hücresi izotonik su ile muamele edilmiştir. B) MMP-1 seviyelerinin β-aktin seviyeleri ile normalize edildikten sonraki hesaplanması.
Şekil 30A; kontrol hücrelerinde, 10 nM ve 100 nM bortezomib konsantrasyonları ile 48 saat muamele edildikten sonra PC3-P ve PC3-R hücrelerinden meydana gelen p16 INK4a ve MMP-1 proteinlerindeki ekspresyon değişikliklerini gösteren Western blot görüntüsüdür. Şekil 30B’de bantların hesaplanmasında görüleceği gibi PC3-P hücrelerindeki 10 nM ve 100 nM bortezomib muamelelerindeki p16 INK4a ekspresyonu PC3-R hücrelerine göre bazal düzeyde daha fazla eksprese olmaktadır. Bu sonuç 24 saat bortezomib muamelesinde elde edilen sonuç ile aynıdır.
A
B
PC3-P Co n PC3-P 10 n
M PC3-P 100 nM
PC3-R Co n PC3-R 10 n
M PC3-R 100 nM 0.00
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
Treatment
MMP-1/β-actin
102
48 saat 100 nM bortezomib muamelesi gruplarından hem PC3-P hem de PC3-R hücrelerinde p16 INK4a ekspresyonu seviyelerinde büyük bir oranda düşüş olmuştur (Şekil 30B). 100 nM bortezomib ilacı her iki hücre hattındaki hücre döngüsü inhibitörü olan p16 INK4a ekspresyonu azalmıştır.
Şekil 30. A) PC3-P ve PC3-R prostat hücre hatlarında, 48 saat ilaç muamelesinden sonra p16 INK4a ve MMP-1 proteinlerinin Western blot görüntüsü. 35 µg protein %12’lik SDS-PAGE’de ayrıştırılmıştır. Western blot, p16 INK4a formlarını tanıyan tavşan monoklonal anti-p16 INK4a (1:1000 dilüsyon, Kat. no: 80772, Cell Signaling) ve MMP-1 formlarını tanıyan tavşan monoklonal anti-MMP-1 (1:1000 dilüsyon, Kat. no: 54376, Cell Signaling) antikorları ile yapılmıştır. Yükleme kontrolleri, tavşan poliklonal anti β-aktin antikoru ile yapılmıştır (1:1000 dilüsyon, Kat. no: 4970, Cell Signaling). Tüm primer antikorlar için sekonder antikor olarak, HRP ile konjuge edilmiş anti-tavşan (1:3000 dilüsyon, Kat. no: 7074, Cell Signaling) antikoru kullanılmıştır. Her iki hücre hattı 48 saat boyunca 10 nM ve 100 nM bortezomib ile muamele edilmiştir, kontrol hücresi izotonik su ile muamele edilmiştir.
B) p16 INK4a ve MMP-1 seviyelerinin β-aktin seviyeleri ile normalize edildikten sonraki hesaplanması.
PC3-P ve PC3-R hücrelerinde, 48 saat boyunca 10 nM ve 100 nM bortezomib muamelesi sonucunda meydana gelen MMP-1 proteinlerindeki ekspresyon değişikliklerine bakıldığında (Şekil 30A ve 30B) ilaç dozuna bağlı olarak PC3-R hücrelerinde MMP-1 protein miktarında azalma vardır. En çok azalma PC3-R hücresinde 100 nM bortezomib uygulamasındadır.
PC3-P ve PC3-R hücrelerindeki kontrol grupları incelendiğinde MMP-1 proteininin bazal seviyelerinin neredeyse aynı olduğu gözlenmektedir (Şekil 30B).
A
B
103
Şekil 30B’ye bakıldığında, PC3-P hücre grubunda, kontrol grubu ile kıyaslandığında, 10 nM bortezomib uygulamasında MMP-1 seviyesi kısmen artarken 100 nM bortezomib uygulamasında ise kısmen azalma gözlenmiştir. Şekil 30B incelendiğinde bortezomib uygulaması, PC3-R hücrelerinde, kontrol hücre grubu ile kıyaslandığında MMP-1, doza bağlı olarak azalmıştır. Hem 24 hem de 48 saat bortezomib uygulamasında genel olarak MMP-1 protein seviyelerinde bir düşme yaşandığı ifade edilebilir. Bu durum p16 INK4a proteini için de benzer şekildedir.
PC3-P ve PC3-R hücrelerinde normal şartlarda (kontrol) ve 100 nM bortezomib uygulaması altında meydana gelen sitokin profillerindeki değişimi incelemek için, 60 sitokinin aynı anda bakılabildiği Human Cytokine Antibody Array Kit’i kullanılmıştır. Bu kit, Tablo 10’da verilen 60 adet sitokini araştırmada kullanılmaktadır. Sitokinler, şartlanmış besiyerlerinde yani ekstrasellüler ortamdaki varlıklarına göre araştırılabileceği gibi hücrelerin lizis edilerek protein ekstraksiyonu yapılarak da araştırılabilirler.
Deneyimizde, hücrelerden protein ekstraksiyonu ile elde edilen örnekler kullanılmıştır. Her bir örneğin protein miktarı ölçülmüştür ve eşit miktarda protein kullanılarak membranlar muamele edilmiştir. Tablo 11, SASP fenotipindeki hücrelerden salgılanan faktörleri göstermektedir. Tablo 11, Tablo 5 ile içerik olarak aynıdır. Tablo 11’de içinde bulunan bazı sitokinler yeşil ile yazılarak farklı şekilde belirtilmiştir. Bu faktörler, Tablo 10’da membran şeması verilen Human Cytokine Antibody Array Kit’inde yer alan ve deneylerimizde incelenmiş faktörlerdir. Tablo 11’de yer alan MMP-1, Human Cytokine Antibody Array Kit’inde yoktur ve kendisi bir sitokin de değildir. MMP-1, yukarıda sonuçlarını aktardığımız Western blot yöntemi ile incelenmiştir.
104
Tablo 10. Abcam sitokin array membranında yer alan faktörlerin şeması. Tablo 11’de yer alan SASP fenotipine özgü faktörlerden, Abcam sitokin array membranında yer alanlar, yeşil renk ile işaretlenmiştir.
A B C D E F G H I J K L M N
1. Pos Pos Neg Neg Blank Angiogenin BDNF BLC BMP-4 BMP-6 CKβ8-1 CNTF EGF Eotaxin
2. Pos Pos Neg Neg Blank Angiogenin BDNF BLC BMP-4 BMP-6 CKβ8-1 CNTF EGF Eotaxin
3. Eotaxin-2 Eotaxin-3 FGF-6 FGF-7 Flt-3 Ligand Fractalkine GCP-2 GDNF GM-CSF l-309 IFN- γ IGFBP-1 IGFBP-2 IGFBP-4 4. Eotaxin-2 Eotaxin-3 FGF-6 FGF-7 Flt-3 Ligand Fractalkine GCP-2 GDNF GM-CSF l-309 IFN- γ IGFBP-1 IGFBP-2 IGFBP-4
5. IGF-1 IL-10 IL-13 IL-15 IL-16 IL-1α IL-1β IL-1ra IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7
6. IGF-1 IL-10 IL-13 IL-15 IL-16 IL-1α IL-1β IL-1ra IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7
7. Leptin LIGHT MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCP-4 M-CSF MDC MIG MIP-1 δ MIP-3 α NAP-2 NT-3 PARC
8. Leptin LIGHT MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCP-4 M-CSF MDC MIG MIP-1 δ MIP-3 α NAP-2 NT-3 PARC
9. PDGF-BB RANTES SCF SDF-1 TARC TGF- β1 TGF- β3 TNF- α TNF- β Blank Blank Blank Blank POS
10. PDGF-BB RANTES SCF SDF-1 TARC TGF- β1 TGF- β3 TNF- α TNF- β Blank Blank Blank Blank POS
105
Tablo 11. SASP genlerinin listesi (Tablo 5 modifiye edilmiştir). Tablo 10’da, Abcam sitokin array membranında yer alan SASP faktörleri yeşil renk ile işaretlenmiştir. Kırmızı renk ile işaretlenen MMP-1 sitokin değildir. Western blot yöntemi ile incelenmiştir.
Şekil 31, PC3-P ve PC3-R hücrelerinde normal şartlarda (kontrol), ve 100 nM bortezomib uygulaması altında meydana gelen sitokin profillerindeki değişimi göstermektedir. Her bir sitokin Tablo 10’da gözüktüğü gibi iki tekrardan oluşmaktadır.
Membran üzerinde bulunan faktörler, üç ayrı renkte dikdörtgen ile işaretlenerek ifade edilmişlerdir. Bu renkler sarı, turuncu ve mavidir.
SASP genlerinin listesi
Activin A HGF MIP-1a
Amphiregulin ICAM-1 MIP-3a
Angiogenin ICAM-3 MMP1
Axl IGF-1 MMP2
bFGF IGFBP-1 MMP3
BMP2 IGFBP-2 MMP10
BMP6 IGFBP-3 MMP12
I-309 (CCL1) IGFBP-4 MMP13
Cathepsin B IGFBP-5 MMP14
CCL16 IGFBP-6 NAP2
CCL3 IGFBP-7 Osteoprotegerin
CD9 IGFBP-rP1, -2 PAI1, -2
CD55 IGFF-2R Pecam1
CSF2RB IL-1a PGE2
CXCL1, -2, -3, -5, -19 IL-1b PIGF
CXCL8 (IL-8) IL-11 PTGES
EGF-3 IL-13 RPS6ka5
EGF IL-15 SCF
EGFR IL-6 SDF-1
Eotaxin-3 IL-7 SGP130
Epiregulin Inhibin A TGFb1
Ets2 IQGAP2 Timp2
FAS Itga2 sTNFRI
FGF7 Itpka tPa
GCP2 Jun TRAIL-R3
GDF 15 KGF uPa
GEM Leptin uPAR
G-CSF MCP-1 (CCL2) VEGFa
GM-CSF MCP-2 (CCL8) VEGFc
Gmfg MCP-3 (CCL7) Wnt2
HCC-4 MCP-4 (CCL13)
Heregulin Mif
106
Şekil 31. PC3-P ve PC3-R prostat hücre hatlarında, ilaç muamelesiz ve 100 nM bortezomib uygulamasında, Abcam sitokin array membranında yer alan 60 faktör ekspresyonunda meydana gelen değişikliklerin görüntüsü. Sarı dikdörtgen içerisinde yer alan faktörler hem kontrol gruplarında hem de muamele gruplarında tespit edilemeyecek kadar azdır. Turuncu dikdörtgen içinde yer alan faktörler istatistiksel olarak anlamlı bir değişim göstermektedir. Mavi dikdörtgen içinde yer alan faktörlerde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim yoktur. Bant yoğunlukları Image J programında protokole göre background kararmalar çıkartılarak yapılmıştır. Şekil düzeltme öncesi orijinal halidir.
İstatistiksel olarak dikkate alınan gruplar şunlardır: 1) P kontrol ve PC3-P 100 nM arasındaki farklılıklar, 2) PC3-PC3-R kontrol ve PC3-PC3-R 100 nM arasındaki farklılıklar, 3) PC3-P kontrol ve PC3-R kontrol arasındaki farklılıklar, 4) PC3-P 100 nM ve PC3-P 100 nM arasındaki farklılıklar.
Abcam sitokin array membranında, bahsedildiği üzere 60 faktör bulunmaktadır. Sonuçlarımızda, Şekil 31’de de görülebileceği gibi, 22 anlamlı değişik gösteren (turuncu dikdörtgen içinde gösterilen), 22 anlamlı değişiklik göstermeyen (mavi dikdörtgen içerisinde gösterilen) ve 5 adet ekspresyon seviyeleri tespit edilemeyecek kadar az olan faktörler (sarı dikdörtgen ile belirtilen) olmak üzere toplam 49 adet faktörün sonucu yer almaktadır. Geriye kalan 11 faktör film banyosu sırasında bu bölgelerde filmde oluşan kararma sebebiyle analize dahil edilmemiştir.
A B C D E F G H I J K L M N 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
PC3-P
PC3-R
Control 1OO nM
107
Bunlar: FGF-7, Flt-3 Ligand, Fractalkine, GCP-2,IL-15, IL-16, IL-1α, IL-1β, 1ra, GM-CSF ve l-309’dur. Bunlardan FGF-7, GM-CSF, l-309, 15, 1α ve IL-1β olmak üzere 6’sı, Tablo 11’de belirtilen SASP proteinleri arasında yer almaktadır.
Şekil 31 üzerindeki sarı dikdörtgen içerisinde yer alan 5 faktör hem kontrol gruplarında hem de muamele gruplarında tespit edilemeyecek kadar azdır. Bu sitokinler, 5, IL-6, IL-7, IL-10, ve IL-13’tür. Bu sitokinler daha çok immün sistem hücreleri tarafından salgılanırlar. PC3 prostat hücre hatlarımızda, ilaçsız normal şartlarda ve çeşitli bortezomib konsantrasyonlarında salgılanmaması bu sebeple normal görülmektedir.
Şekil 31 üzerindeki turuncu dikdörtgen içinde yer alan faktörler istatistiksel olarak anlamlı bir değişim göstermektedir. Buradaki 22 adet faktörde, istatistiksel olarak dikkate alınmış gruplar arasından en az birinde fark bulunmuştur ve grafikleri Şekil 32’de verilmiştir. Grupları arasından anlamlı değişiklik gösteren bu faktörler şunlardır:
BMP-4, BMP-6, CK β 8-1, CNTF, EGF, Eotaxin, Eotaxin 3, FGF-6, IFN-γ, IGFBP-1, IGFBP-2, IGF-IGFBP-1, MCP-IGFBP-1, MCP-4, M-CSF, MDC, MIG, MIP-1δ,MIP-3α, Nap-2, NT-3 ve PARC’tır. Şekil 31 üzerindeki mavi dikdörtgen içinde yer alan faktörlerde ise istatistiksel olarak anlamlı bir değişim yoktur. Bu faktörlerin sayısı da 22 olmuştur ve grafikleri Şekil 33’te verilmiştir. Grupları arasında anlamlı değişiklik görülmeyen bu faktörler şunlardır: Angiogenin, BDNF, BLC, Eotaxin 2, GDNF, IGFBP-4, 2, IL-3, IL-4, Leptin, LIGHT, MCP-2, MCP-IL-3, PDGF-BB, RANTES, SCF, SDF-1, TARC, TGF-β1,TGF-β3, TNF-α ve TNF-β’dır.
Tablo 11’de verilen SASP proteinleri arasında yer alan ve Tablo 10’da Abcam sitokin array membranında bulunan faktörler bahsedildiği üzere ortak olarak yeşil renk ile işaretlenmiştir. Bunlar: Angiogenin, BMP6, I-309 (CCL1), EGF, Eotaxin-3, FGF-7, GM-CSF, IGF-1, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IL-1α, IL-1β, IL-13,IL-15, IL-6, IL-7, Leptin, MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL7), MCP-4 (CCL13), MIP-3α, NAP-2, SCF, SDF-1 ve TGF-β1 olmak üzere 27 adet sitokindir. Bunlardan 6’sı (FGF-7, GM-CSF, l-309, IL-15, IL-1α ve IL-1β) yukarıda bahsedilen incelenemeyen 11 faktör arasında yer almaktadır ve kalan 3’ü ise (IL-13, IL-6, IL-7) sarı dikdörtgen ile işaretli ve ekspresyon seviyeleri belirlenemeyecek kadar az olan sitokinler arasında yer almaktadır. Bu sebeple, 18 tanesi incelenmiştir (Angiogenin, BMP-6, EGF, Eotaxin-3, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IGF-1, Leptin, 1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-3α, NAP-MCP-2, SCF, SDF-1, TGF-β1).
108
PC3-P ve PC3-R hücrelerinde 100 nM bortezomib varlığında ve ilaç verilmeyen kontrol gruplarındaki bu 18 sitokin profilinde meydana gelen istatistiksel olarak anlamlı değişim gösterenler Şekil 32’de verilmişken istatistiksel olarak anlamlı bir değişim göstermeyenler ise Şekil 33’te verilmiştir. Bu 18 sitokin, Şekil 32 ve Şekil 33’te, Tablo 10 ve 11’de olduğu gibi yeşil çerçeve içerisine alınarak belirtilmiştir.
Abcam sitokin array, SASP proteinlerinde meydana gelen değişim açısından incelendiğinde özet olarak; 18 SASP proteini arasında bulunan 8 proteinin, karşılaştırılan grupları arasında hiçbir önemli değişiklik oluşmamıştır (Angiogenin, IGFBP-4, Leptin, MCP-2, MCP-3, SCF, SDF-1 ve TGF-β1) (Şekil 33).Deney grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı sonuç veren 10 sitokin vardır (BMP6, EGF, IGFBP-1, IGFBP-2, MCP-1, Eotaxin 3, IGF-1, MCP-4, MIP-3α ve NAP-2). İkisi (BMP-6, IGFBP-2) her iki hücre hattında olmak üzere kontrole göre ilaç muamele grubu karşılaştırıldığında toplam 5 SASP protein ekspresyonunda (BMP6, EGF, IGFBP-1, IGFBP-2 ve MCP-1) azalma gözlenmiştir (Şekil 32). Kontrol grubuna kıyasla bir artış yalnız Eotaxin 3, IGF-1, MCP-4 ile MCP-1’de ve sadece dirençli hücre hattı olan PC3-R hücrelerinde gözlenmiştir. MIP-3α ve NAP-2 ekspresyon seviyeleri ilaç uygulamaları ile değişmemiştir fakat bazal düzeyde dirençli hücrelerde parental hücrelere göre daha fazla eksprese olduğu gözlenmektedir.
PC3-P ve PC3-R hücrelerinde senesens mekanizmasının araştırılmasında elde edilen tüm sonuçların özeti aşağıdaki gibidir: İkisi (BMP-6, IGFBP-2) her iki hücre hattında olmak üzere kontrole göre ilaç muamele grubu karşılaştırıldığında, toplam 5 SASP proteininde (BMP6, EGF, IGFBP-1, IGFBP-2 ve MCP-1) azalma gözlenmiştir.
Ayrıca, Tablo 11’de SASP proteinleri arasında yer alan MMP-1’in ekspresyonun hem PC3-P hem de PC3-R hücrelerinde 100 nM bortezomib uygulamasında, kontrol gruplarına göre 24 saat (Şekil 23) ve 48 saat (Şekil 30) ilaç uygulamasında azaldığı Western blot yöntemi ile gösterilmiştir. Yine Western blot yöntemi ile p16 INK4a’nın 48 saat 100 nM bortezomib uygulamasında kontrol grubuna göre her iki hücre hattında da düştüğü gösterilmiştir (Şekil 30). Şekil 26’da SA-β-Gal aktivitesine bakıldığında bortezomib muamelesi sonucunda PC3-P hücrelerinde bu aktivitenin azaldığı da görülmüştür. Tüm bu sonuçlar bir proteozom inhibitörü olan bortezomib’in senesensi azaltıcı yönde etki ettiğine ve bir senolitik ilaç adayı olabileceğine işaret etmektedir.
109
Buna ek olarak, SA-β-Gal aktivitesinin PC3-R hücrelerinde daha az olması ve 24 saatlik Western blot deneylerinde hem p16 INK4a hem de MMP-1 proteinin kontrol gruplarındaki bazal seviyesinin PC3-R hücrelerinde daha az olması, dirençli hücrelerin daha az senesense uğradığına işaret edebilir. Literatüre göre senesensten kaçış ilaç direnç mekanizmaları arasında yer almaktadır (Rebbaa A., 2005) ve bu sebeple PC3-R hücrelerindeki direnç mekanizmasına katkı sağlayabilir.
Tüm sitokin array içerisinde analiz edilebilen 49 sitokinin sonuçları incelendiğinde, 22 sitokinin hiçbir grubunda anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 33). İstatistiksel olarak dikkate alınan gruplar arasında en az bir fark olan sitokinler de 22 adettir (Şekil 32). Bu faktörler arasında kontrol grubu ile 100 nM bortezomib muamelesi karşılaştırıldığında, PC3-P ve PC3-R hücrelerinde 49 sitokin arasından 12’sinin ekspresyonu en az bir deney grubunda olmak üzere azalmıştır (Şekil 32). Bunlar: IGFBP-2, CKβ8-1, MCP-1, 6, CNTF, Eotaxin, IFN-γ, BMP-4, IGFBP-1, EGF, MDC ve PARC’tır. Parental PC3-P hücrelerinin kontrol grubu ile 100 nM bortezomib muamelesi karşılaştırıldığında, hiçbir sitokinin ekspresyonunda artış olmamıştır.Dirençli PC3-R hücrelerinin kontrol grubu ile 100 nM bortezomib muamelesi karşılaştırıldığında, sadece 6 sitokinde anlamlı bir artış vardır. Bunlar: IGF-1, MIP-1δ, NT-3, Eotaxin 3, MCP-1 ve MCP-4’tür. MCP-1 faktöründe ise PC3-P hücrelerinde düşme yaşanmıştır.
Sitokin array içerisinde yer alan faktörlerin PC3-R ve PC3-P hücrelerindeki bazal seviyeleri karşılaştırıldığında MIP-3α, PARC, NAP-2, BMP-6, CNTF ve FGF-6 faktörlerinin bazal seviyelerinin dirençli PC3-R hücrelerinde parental PC3-P hücrelerine göre daha fazla eksprese olduğu gözlenmiştir (Şekil 32). Bu faktörlerin dirence olası katkıları ‘TARTIŞMA ve SONUÇ’ bölümünde yorumlanmıştır.
110
111
Şekil 32. PC3-P ve PC3-R hücre hatlarında 100 nM bortezomib muamelesi sonrasında, Abcam sitokin array membranında yer alan ve deney grupları arasında anlamlı değişiklik gösteren sitokinlerin bar grafikleri. Yeşil çerçeve ile belirtilen sonuçlar tablo 10’daki SASP faktörleri arasındadır. Tüm bar grafikleri ± SD ortalaması şeklinde verilmiştir ve iki teknik tekrarın temsilcisidir.
*P <0,05, **P <0,01.
112
113
Şekil 33. PC3-P ve PC3-R hücre hatlarında 100 nM bortezomib muamelesi sonrasında, Abcam sitokin array membranında yer alan ve deney grupları arasında anlamlı değişiklik göstermeyen sitokinlerin bar grafikleri. Yeşil çerçeve ile belirtilen sonuçlar tablo 10’daki SASP faktörleri arasındadır. Tüm bar grafikleri ± SD ortalaması şeklinde verilmiştir ve iki teknik tekrarın temsilcisidir. *P <0,05, **P <0,01.
114