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Para evitar possíveis mascaramentos dos padrões de variação morfológica por diferenças atribuídas ao sexo dos indivíduos (dimorfismo sexual), a prova univariada do teste T (Student’s T-test) foi realizada entre os machos e as fêmeas para cada uma das

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variáveis morfométricas. No caso das variáveis merísticas, o teste não-paramétrico de Wilcoxon foi empregado para avaliar o dimorfismo sexual de cada variável. A presença de dimorfismo sexual no interior de cada um dos grupos estabelecidos pelos critérios de agrupamento (Subespécies e Padrão de Coloração) e a diferença entre estes grupos foi avaliada mediante o uso da análise de variância de duas vias (two-way ANOVA). Esta análise foi efetuada para cada uma das variáveis quantitativas empregando-se como fatores (variáveis independentes) o sexo e os critérios de agrupamento.

Comparação entre grupos

Uma vez que os indivíduos foram organizados de acordo com os dois critérios de agrupamento, as diferenças entre as variáveis quantitativas dos grupos foram avaliadas através de uma série de análises estatísticas descritivas, univariadas e multivariadas. A seguir são descritas detalhadamente e passo por passo as análises estatísticas utilizadas nas comparações entre os grupos.

1. Estatísticas descritivas (amplitude, média e desvio padrão) de cada uma das variáveis quantitativas de cada grupo.

2. Gráficos de estatística descritiva (Histogramas e Diagramas de Caixa) para cada variável (morfométricas e merísticas) e entre os grupos definidos por cada critério.

3. Teste de normalidade empregando-se tanto o teste de Kolmogorov-Smirnov (K-S) como o de Shapiro-Wilk (S-W) para cada variável, em cada grupo.

4. Analise de variância (ANOVA) entre os grupos quando as variáveis são normais (i. e. aquelas que apresentaram uma distribuição normal nos testes de K-S e S-W) e teste de Kruskal-Wallis entre os grupos quando as variáveis não são normais.

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5. Ajuste de Bonferroni para cada ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis realizado entre as variáveis dos agrupamentos de subespécies.

6. Análise de componentes principais (PCA) para as variáveis morfométricas e análise de coordenadas principais (PCoA) para as variáveis merísticas. Nos gráficos destas análises, os grupos foram delimitados por um polígono do primeiro componente principal (CP1)/coordenada principal (CoP1) versus o segundo componente principal (CP2)/coordenada principal (CoP2). Por conta da natureza dos dados, o PCA das variáveis morfométricas foi realizado usando a matriz de variância-covariância. Já para as variáveis merísticas, o PCoA foi realizado empregando-se a matriz de distância ou de dissimilaridade construída a partir o índice de Gower.

7. Análise de funções discriminantes (DFA) entre os grupos definidos para cada critério. Adicionalmente, as porcentagens de reclassificação (PRC) foram calculadas para cada grupo.

8. Análise multivariada de variância (MANOVA) entre os grupos empregando-se as variáveis morfométricas e análise de variância multivariada com permutações (pMANOVA) entre os grupos empregando-se as variáveis merísticas.

Os histogramas e os diagramas de caixa (box plots) foram construídos com o propósito de obter uma visão preliminar da variação morfológica para cada variável e entre os grupos definidos por cada critério. Para avaliar o padrão de distribuição de cada variável nos grupos definidos foram empregados es testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e de Shapiro-Wilk. A ANOVA e o teste de Kruskal-Wallis foram utilizados com o propósito de detectar diferenças significativas entre os grupos, para cada variável. O Ajuste de Bonferroni foi empregado para detectar entre quais das três subespécies existe diferença significativa, para cada variável.

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O PCA e o PCoA foram empregados para avaliar a distribuição dos exemplares no espaço multivariado sem uma hipótese de agrupamento prévia. Por definição, tanto o PCA como o PCoA não são elaborados com a postulação prévia de uma hipótese de agrupamento, portanto nos gráficos de CP1/CoP1 vs CP2/CoP2 deste estudo, os grupos foram apresentados como delimitações espaciais (polígonos) dos indivíduos agrupados pelos critérios.

A DFA foi efetuada para avaliar a distribuição dos exemplares no espaço multivariado com uma hipótese a priori de agrupamento. Para esta análise, as hipóteses empregadas foram os dois critérios de agrupamento de indivíduos usados neste estudo. Na Tabela de reclassificação da DFA, cada indivíduo é classificado de acordo com as suas informações (variáveis) no interior de um dos grupos definidos. Com isto, as PRC foram calculadas para avaliar como a DFA classificou os indivíduos nos diferentes grupos. Para testar a hipótese de estudo baseando-se no critério das subespécies, foram feitas duas DFA empregando-se como hipóteses a priori os dois agrupamentos SD e ND (ver Tabela 4).

A MANOVA e a pMANOVA foram usadas para elucidar a possível presença de diferenças entre os agrupamentos de cada critério. Para detectar diferenças entre os grupos com a MANOVA, foram empregados quatro estatísticas diferentes, Wilks-Lambda, Hotelling–Lawley, Pillai e Roy. Para determinar diferenças entre os grupos com a pMANOVA foram empregadas 1000 permutações sobre a mesma matriz de distância de dissimilaridade empregada no PCoA.

A construção e edição das matrizes dos dados morfológicos foi realizada no programa Excel do pacote Office 2007 Professional Plus. As análises estatísticas foram efeituadas no programa R, versão 2.13. Na realização dos gráficos de estatística descritiva (Histogramas e Diagramas de Caixa) e dos gráficos de estadística multivariada (PCA, PCoA e DFA) foi utilizado o pacote “graphics” para o programa R (R Development Core Team 2011).

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Scripts para a realização dos gráficos foram tomados e modificados de Maindonald e Braun (2008). Para o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado o pacote “nortest” para o programa R (Gross sem data). Para os testes de Shapiro-Wilk, T-Student, Wilcoxon, ANOVA, Kruskal-Wallis, PCA, PCoA e MANOVA foi utilizado o pacote “stats” para o programa R (R Development Core Team 2011). Para two-way ANOVA foi empregado o pacote “car” para o programa R (Fox e Sanford 2011). Para a DFA foi utilizado o pacote “MASS” do programa R (Venables e Ripley 2002) Para a pMANOVA e para a construção da matriz de dissimilaridade das variáveis merísticas foi empregado o pacote “vegan” para o programa R (Oksanen et al. 2011). A estimativa de dados faltantes com o algoritmo EM foi realizado utilizando o pacote “norm” para o programa R (Novo 2010).

3.6.2. Análises de Anatomia Comparada.