V. BÖLÜM

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

5.1 S ONUÇLAR

Rédacteur(s) :

Olivier Firmesse, Francoise Dilasser, Sylviane Derzelle Approbateur :

Olivier Firmesse

Le kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III est localisé pièce 119 placard P1 et P2 – idem pour les plastiques nécessaires à l’analyse.

1. Précautions :

Particules MGP : La suspension de particules magnétiques (bouchon brun) doit être vortexée. Mélanger immédiatement avant usage afin d’avoir une suspension homogène.

Protéinase K : Reconstituer chaque flacon (bouchon rose) en ajoutant 1,2 ml de tampon d’élution (bouchon jaune) –bien mélanger. 1 flacon est nécessaire pour 32 extractions. Une fois reconstitué le produit est stable pendant 1mois de 2 à 8°C ou 1 an entre -15 et -25°C.

Ne pas utiliser un tampon qui contient un précipité. Si un précipité est visible, placer le flacon à 37°C et mélanger de temps en temps jusqu’à dissolution complète du précipité.

2. Préparation des échantillons : (pour l’extraction simultanée de 32 échantillons maximum) - Allumer 2 bains secs : l’un à 65°C et l’autre à 95°C (15 à 30 min avant utilisation)

- Allumer l’appareil MagNA Pure (chauffage des blocs) et le système informatique - Mettre 1 ml d’une culture bactérienne dans un tube eppendorf de 1,7 ml.

- Centrifuger les cultures à 15000 g pendant 3 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et conserver le culot.

- Resuspendre le culot bactérien dans 200 µl de tampon phosphate salin (PBS).

- Ajouter dans chaque tube, 180 µl de tampon de lyse (bouteille 7 incolore) au 200 µl d’échantillon. Bien homogénéiser en vortexant 5 sec.

- Ajouter 20 µl de protéinase K (bouteille rose reconstituée, SRPI FC20 pièce 118 F20) au mélange et mélanger délicatement par pipetage.

- Incuber pendant 10 min à 65°C (ler bain sec). Mettre des cavaliers pour éviter que les tubes ne s’ouvrent.

- Incuber ensuite les échantillons à 95°C pendant 10 min.

- Centrifuger brièvement les tubes (centrifugeuse de paillasse) afin de collecter la totalité de l’échantillon au fond du tube.

- Pipeter la totalité des échantillons (400 µl) et les mettre dans des tubes de 2 ml contenant 250 µl de billes de verre (200 µm de diamètre, Sigma).

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- Homogénéiser les échantillons à l’aide du MagNA Lyser (vitesse : 6000 ; temps : 30 sec).

- Prélever 200 µl de chaque échantillon et procéder au transfert dans la cartouche MagNA Pure LC Sample cartridge (support plastique contenant 4x8 puits).

La purification de l’ADN est réalisée par l’automate. Consulter son Mode opératoire.

Ne pas oublier que seulement la moitié de l’échantillon est purifiée.

3. Chargement du robot extracteur :

- Positionner un récupérateur de gouttes (Tub lid seal) sur le bras du robot. Cliquer sur Change dropcatcher pour déplacer le bras vers l’avant. Placer le récupérateur de gouttes avec des pinces, puis cliquer sur Home pour repositionner le bras de l’automate.

- Lancer le logiciel qui gère l’appareillage. Sélectionner le protocole DNA III Bacteria. Suivre les instructions du logiciel et renseigner le nombre d’échantillons à traiter (entrer la nature et le nom des échantillons). Préciser le volume de l’échantillon (200 µl) et le volume d’élution (100 µl). Appuyer ensuite sur OK. L’écran d’information « Start information Screen » apparaît. Le logiciel a calculé les quantités de réactifs nécessaires.

- Positionner les consommables plastiques dans l’appareil (se référer à l’écran d’information pour leur place et leur nombre).

- Sortir le rack des bacs à réactifs et le remplir avec 6 bacs (Reagent tub) (2 large et 4 moyen). Remplir tous les bacs avec la quantité de réactif demandée (le volume à pipetter dans chaque récipient est indiqué sur l’écran d’information). Un guide avec des bordures colorées est placé sur le rack pour aider au bon chargement des réactifs (correspondance de couleur), puis fermer avec le couvercle correspondant (Tub Lid).

Remplir le bac contenant les billes magnétiques MGPs au dernier moment : après avoir

chargé les échantillons et juste avant de lancer l’extraction !!!

- Transférer les bacs à réactifs et la cartouche contenant les échantillons dans le robot.

- Sur l’écran, confirmer le positionnement correct des consommables et réactifs en cliquant sur le schéma des récipients respectifs. Cliquer sur « OK » pour démarrer l’automate. Vous ne pourrez démarrer l’appareil que si la station de travail est fermée.

- En fin d’extraction, récupérer la cartouche contenant les ADN purifiés et jeter les consommables plastiques (seules les pointes excédentaires sont conservées).

- Fermer la cartouche contenant les ADN purifiés avec un adhésif (Cartridge seal) ou (et cela est préférable) transférer chaque échantillon d’ADN purifié dans un tube eppendorf à faible rétention identifié. Conserver l’ADN à -20°C (congélateur C24, pièce 125-3).

- Retirer le récupérateur de gouttes (Tub lid seal). Cliquer sur Change dropcatcher pour déplacer le bras vers l’avant. Faire glisser le plastique avec des pinces, puis cliquer sur Home pour repositionner le bras de l’automate.

- Lancer la décontamination de l’appareil. Cliquer sur décontamination. Edition : Start.

4. Principe du test :

La procédure d’isolement est basée sur une technologie de billes magnétiques. Les échantillons sont lysés par incubation dans un tampon contenant des sels chaotropiques et de la protéinase K. Des particules en verre magnétisées sont ajoutées et l’ADN se fixe à leur surface. Les substances non fixées sont enlevées par l’intermédiaire de plusieurs lavages, puis l’ADN est élué. Les étapes du principe de l’isolement de l’ADN sont les suivantes.

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1 2 3 4 5 6

1. L’échantillon est placé dans les puits de la cartouche (Sample Cartridge).

2. Le tampon de lyse et de fixation est ajouté à l’échantillon, favorisant la lyse cellulaire complète et le re-largage des acides nucléiques. Les nucléases sont dénaturées. La protéinase K dénature les protéines.

3. L’ADN se fixe à la surface de silice des billes grâce aux conditions chaotropiques, à l’isopropanol et à la haute stringence ionique du tampon de Tp de lyse et d’accrochage (bouteille 4, vert).

4. Les billes sur lesquelles l’ADN s’est fixé sont magnétiquement séparées du reste de l’échantillon lysé (bouteille 5 brun)

5. Les billes sont lavées plusieurs fois avec du tampon de lavage (bouteilles 1,2 et 3; noire, bleu et rouge) pour éliminer les protéines (nucléases), membranes, inhibiteurs de la PCR, et pour réduire enfin la concentration en sel.

6. Les billes sont magnétiquement séparées du tampon de lavage contenant les débris résiduels. 7. L’ADN purifié est élué (bouteille 6, jaune) des billes magnétiques à 70°C et transféré dans la cartouche d’élution tandis que les billes sont retenues dans le cône de réaction, puis jetées.

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Annexe 2

Mode opératoire pour l’extraction à partir du kit PrepSeq™ rapid spin sample Applied (réf 4407760) 3 min 17 000 g Elimination du surnageant Ajout 650 µL H2O PCR + 20 µL IPC Témoin d’extraction EPT + 20 µL IPC Transfert dans la colonne 3 min 17 000 g PCR (LC 480 II – Roche/ Mix PCR Probe Master – Roche)

Elimination de la colonne et du surnageant Ajout 50 µL de lysis buffer + 5 µL de protéinase K à 20 mg/ml 30 min à 56°C 12 min à 97°C 1 min 17 000 g Ajout 250 µL H2O PCR 1 min 17 000 g Transfert du surnageant dans un nouveau µtube pour utilisation PCR 1 ml de

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Annexe 3

Mode opératoire pour l’extraction à partir du kit DNeasy® Blood and Tissue kit (Qiagen)

1 ml enrichissement Centrifuger 16000 g 3min

Eliminer le surnageant

Resuspendre dans 180 µL de tampon de lyse (lysosyme) Incuber 1h à 37°C

ajouter 25 µL de Protéinase K Incuber 30 min à 56 °C Ajouter 200 µL d'éthanol 96% Placer une colonne dans un tube de 2ml Transférer la suspension dans la colonne

Centrifuger > 6 000 g 1 min

transférer la colonne dans un nouveau tube et jeter l'autre Ajouter 500 µL de tampon AW1

Centrifuger > 6 000 g 1min

Transférer la colonne dans un nouveau tube et jeter l'autre Ajouter 500 µL de tampon AW2

Centrifuger à 17 000 g 5 min

Transférer la colonne dans un micro tube de 1,5 ml Ajouter 100 µL de tampon AE

laisser à température ambiante 1 min centrifuger > 6 000 g 1min

Ajouter 100 µL de tampon AE une nouvelle fois laisser 1 min à T°C ambiante

centrifuger > 6 000 g 1 min Mesurer la concentration d'ADN

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Annexe 4

Mode opératoire modifié pour l’extraction à partir du kit Wizard Genomic DNA Purification Kit (ref CAT A1120) de PROMEGA

Pellet Cells

Centrifuge 2 ml of overnight culture for 2 minutes at 16,000 × g and check OD at 600 nm (around 2.4+/-0.3)

Discard the supernatant.

Suspend cells in 480μl 50mM EDTA.

Add lytic enzyme(s) (120μl) [(60ul of Lysozyme at 10 mg/ml + 60ul of Lysostaphin at 10 mg/ml)]

Incubate at 37°C for 60 minutes.

Centrifuge for 2 minutes at 16,000 × g and remove supernatant. Add 600μl Nuclei Lysis Solution. Pipet gently to mix.

Incubate for 10 minutes at 80°C, then cool to room temperature. Add 3μl of RNase Solution. Mix, incubate at 37°C for 60 minutes, then cool to room temperature.

Add 200μl of Protein Precipitation Solution. Vortex. Incubate on ice for 15 minutes.

Centrifuge at 16,000 × g for 3 minutes.

Transfer the supernatant (aroud 600+/-50ul) to a clean tube containing 600μl of room temperature isopropanol. Gently mix.

Centrifuge as in “Pellet Cells” above, and decant the supernatant.

Add 600μl of room temperature 70% ethanol. Take down the pellet with the tip and gently Mix.

Centrifuge for 2 minutes at 16,000 × g.

Aspirate the ethanol and air-dry the pellet overnight.

Rehydrate the DNA pellet in 100μl of water or Tris 10 mM

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ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

In document İlköğretim ve ortaokul müzik ders kitaplarındaki şarkıların müzikal öğeler bakımından incelenmesi (1996-2016) (Page 58-70)

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