4. OLGUN CİLDİN TEMİZLİĞİ VE BAKIMI
4.6. Olgun Ciltler İçin Salon (Enstitü ) Bakımı İşlem Sıralaması
5.1 Atividade Antibacteriana e Moduladora do extrato de Sargassum
polyceratium e do isolado feofitina
Nenhum dos extratos de Sargassum polyceratium nem o isolado de 132-hidroxi-(132-R)-feofitina a e 132-hidroxi-(132-S)-feofitina a apresentaram atividade antibacteriana relevante contra as estirpes de S.
aureus utilizadas (CIM ≥ 10β4 ug / mL) (Tabela 02).
Tabela 02. Concentrações inibitórias mínimas (CIM) de antibióticos, extratos e
feofitina contra linhagens Staphylococcus aureus. CIM (µg/mL)
Linhagens IS-58 RN 4220 AS-1199B Antibiótico 32 256 64 Extrato EtOH >1024 >1024 >1024 Extrato Hexânico >1024 >1024 >1024 FR 101-104 >1024 >1024 1024
Porém, quando foram incorporados ao meio numa concentração de 512 ug/ mL (≥1/4 CIM), eles modificaram a atividade antibiótica, modulando entre 2x à 4x a resistência bacteriana (Tabela 03). É importante mencionar que o uso de uma concentração tão baixa quanto ¼ da CIM é recomendada para evitar possíveis resultados falso-positivos.
Tabela 03. Atividade Moduladora da resistência a drogas contra linhagens Staphylococcus aureus.
Modulação (µg/mL)
Linhagens IS-58 RN 4220 AS-1199B Antibiótico 32 256 64 Extrato EtOH 16 (2x) 128 (2x) 64 Extrato Hexânico 16 (2x) 64 (4x) 64
Os extratos de Sargassum polyceratium e do isolado Sp-1 (132-
hidroxi-(132-R)-feofitina a e 132-hidroxi-(132-S)-feofitina a) aumentaram
a atividade antibiótica através da redução das concentrações necessária para inibir o crescimento das linhagens de Staphylococcus aureus resistentes (efluxo de drogas). O extrato Hexânico, que é o mais apolar, foi o que apresentou melhor resultado, modulando em 4x para eritromicina. Isto pode ser explicado, pois um caráter lipofílico pode afetar a solubilidade da membrana e interagir com as proteínas de efluxo (ANEIROS et al, 2004; STAVRI et al, 2007), ou talvez interferir no local de substrato da bomba (GIBBONS, 2004), causando inibição da remoção da droga, embora outros meios de inibição de bomba de efluxo, tais como um efeito sobre a transcrição/tradução da bomba, não pode ser descartada (FALCAO-SILVA et al, 2009; ZLOH et al, 2004).
Stermitz FR (2001) publicou que a feofitina a (derivado de fitol pheophorbide a) não têm atividade inibitória da bomba de MDR. Porém este resultado não foi visualizado com a feofitinautilizada em nosso experimento, pelo contrário. A mistura de feofitina que nós testamos apresentou atividade moduladora contra as linhagens RN 4220 e AS-1199B. Observamos também que a feofitina foi a única que apresentou atividade moduladora para a linhagem Nor-A, Isto deve ter ocorrido pois, quando testada em uma mistura, poderia ter outros compostos existentes que inibiriam a sua atividade.
Assim, a aplicação desses inibidores em associação com antibióticos convencionais poderá aumentar a concentração intracelular desses antibióticos, restaurando sua eficiência, além de reduzir o emergente desenvolvimento da resistência bacteriana (SMITH et al, 2007; OLIVEIRA et al, 2011)
5.1.1 Método de Checkerboard
O estudo dos efeitos interativos entre as moléculas tem uma longa história. Para antimicrobianos, o uso de combinações de agentes inibitórios na clínica geralmente começa com testes in vitro que mostram interações positivas ao inibir o crescimento de microrganismos alvo. Há muitos modelos experimentais para medir tais efeitos combinados e uma das formas mais conhecidas é o testes de Chequerboader (Lomovskaya e Watkins, 2001).
No método de checkerboard também foi possível observar o efeito de sinergismos (∑FIC ≤ 0,5) entre a Sp-1 e os antibióticos eritromicina e norfloxacina. Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes com resultados consistentes.
Foi observado que o composto Feofitina agiu sinergicamente com os antibióticos eritromicina e norfloxacina, reduzindo em 2 vezes a concentração dos antibióticos necessário para inibir o crescimento bacteriano, ou seja, a atividade da combinação antimicrobiana é substancialmente maior que a ação da droga mais ativa isoladamente.
Combinações de antimicrobianos são particularmente úteis no tratamento de infecções graves ou em indivíduos imunocomprometidos, assim como em terapêuticas empíricas ou quando se quer prevenir o surgimento de resistência ou, ainda, quando se deseja potencializar o efeito bactericida de um tratamento diante do agente infeccioso.
5.2 Atividade Antibacteriana e Moduladora dos extratos de Dictyota pulchella e do isolado diterpeno
Realizamos primeiramente experimentos para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos Dictyota pulchella e dos
FIC Nor = MIC Nor comb/MIC Nor só = 16/64 = 0,25 FIC F = MIC F comb/MIC F só = 256/ 1024 = 0,25
FIC Nor + FIC F = 0,25 + 0,25 = 0,5 FIC Eri = MIC Eri comb/MIC Eris ó = 32/256 = 0,125
FIC F = MIC F comb/MIC F só = 512/ 2048 = 0,25 FIC Eri + FIC F = 1,125 + 0,25 = 0,375
isolados diterpenos em linhagens de Staphylococcus aureus que codificam proteínas de efluxo. Foi possível observar que tanto os extratos quanto os diterpenos não apresentaram atividade antibacteriana relevante para as linhagens SA-1199B, IS-58 e RN-4220 (Tabela 4).
Tabela 04. Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) dos antibióticos, extrato,
fases e diterpeno MIC µg/mL IS-58 RN 4220 AS-1199B Antibiótico 32 256 64 Dictyota pulchella* (CIM/4) 512 1024 1024 Dictyota pulchella* (MIC/8) 512 1024 1014 Hex:AcOEt (8:2) 256 256 256 Hex:AcOEt (9:1) 1024 1024 1024 Dp-1 1024 1024 1024 Dp-3 (a e b) 1024 1024 1024
*¹ Experiência realizada na Monografia (2011).
O extrato de Dictyota pulchella apesar de não ter apresentado atividade antibacteriana relevante (CIM ≥ 512 µg/mL), quando foi incorporado ao meio de cultura mesmo na concentração correspondente a 1/8 de sua CIM, houve redução da concentração da tetraciclina e da eritromicina necessária para inibir o crescimento bacteriano, indicando inibição da bomba de efluxo (Tabela 04). O extrato de Dp reduziu o CIM dos antibióticos em até 8x e 256x para tetraciclina e eritromicina, respectivamente. Porém, não se observou modulação da resistência ao norfloxacino (Monografia Suellen-2011).
Tabela 05. Atividade Moduladora da resistência a drogas contra linhagens Staphylococcus aureus MODULAÇÃO IS-58 RN 4220 AS-1199B Antibiótico 32 256 64 Dictyota pulchella* (CIM/4) 4 (8x) 1 (256x) 64 Dictyota pulchella* (CIM/8) 8 (4x) 8 (32x) 64 Hex:AcOEt (8:2) 16(2x) 128 (2x) 64 Hex:AcOEt (9:1) 4 (8x) 128 (2x) 64 Dp-1 8 (4x) 16 (16x) 16 (4x) Dp-3 (a e b) 8 (4x) 16 (16x) 16 (4x)
*¹ Experiência realizada na Monografia (2011).
*³ Entre parênteses, os fatores de redução da CIM (fator de modulação).
Nenhuma das fases e nem os diterpenos também não apresentaram atividade antibacteriana relevante. Porém, eles modularam a resistência bacteriana (Tabela 04).
As fases Hex:AcOEt (8:2) e Hex:AcOEt (9:1) modularam entre 2 e 8 vezes a atividade antimicrobiana para os antibióticos tetraciclina e norfloxacina. Ou seja, antes era necessário 32 microlitros (µg/mL) do antibiótico tetraciclina para inibir o crescimento bacteriano e com a adição da fase (8:2), em uma concentração subinibitória, passou a ser necessário 16 µg/mL do antibiótico para matar a célula bacteriana (Tabela 04). A fase (8:2) obteve uma atividade moduladora menos eficaz que a fase (9:1) e isto pode ser explicado devido a diferença de polaridade. Ou seja, de acordo com Stavri (2007) a lipofilicidade pode ser o fator chave para inibir a bomba de efluxo em bactérias gram-positivas.
Ambos os diterpenos apresentarão atividade moduladora, reduzindo a CIM dos antibióticos entre 4 e 16 vezes. Resultado similar já foi observado para o diterpeno Totarol (EILEEN et al, 2007), afirmando que ele age diretamente, isto é, ligando-se a bomba, ou indiretamente, talvez ligando- se ao substrato bomba ou afetando a montagem, conformação, ou mesmo a tradução da bomba. Porém, o diterpeno que nós testamos apresentou uma melhor atividade moduladora para a linhagem RN4220(MsrA).
Quando analisamos os diterpenos com as fases em que eles foram extraídos, podemos observar que os diterpenos possuem uma atividade moduladora melhor que as fases. Esta diferença pode ser explicada, pois nas fases devem existir outros compostos que interferem no resultado do diterpeno isolado. Também foi possível observar que os diterpenos apresentaram atividade modificadora do antibiótico Norfloxacina, melhorando sua eficácia frente a linhagem Nor-A. Porém, nem as fases e nem o extrato bruto apresentaram tal atividade. Isto deve ter ocorrido, pois eles estão isolados e consequentemente em uma concentração maior e assim a sua ação será mais aficaz, mas também possa ser que exista compostos que possam se ligam ao diterpeno inibindo sua atividade.
Estudos biológicos já revelam que um número significativo de metabólitos secundários isolados de espécies de Dictyota possuem atividades biológicas (DURAN et al., 1997).
Os resultados aqui apresentados indicam que alga Dictyota pulchella é uma potencial fonte de adjuvantes de antibióticos. A qual reduziu a quantidade de antibiótico necessária para inibir o crescimento bacteriano.
5.3. Atividade Antibacteriana Mediada por Luz UV-A
Dentre os 7 extratos de algas testados, apenas 3 (Sargassum
polyceratium EtOH, Hexânico e o extrato de Dictyota pulchella (dicloro
metano:metanol) apresentaram atividade antibacteriana mediada por luz sobre as linhagens RN-4220, SA-1199B e ATCC 6538.
Compostos químicos, tais como os derivados de porfirina (Lasocki, 1999; Lambrechts, 2005) e sais de fenotiazinas (Tegos,2006; Bisland, 2006) foram estudados e visto que eles demonstram alto efeito bactericida contra S. aureus após a exposição com luz UV.
Como controle positivo utilizamos o DMSO, que mesmo exposto a radiação, não houve aparecimento de alo de inibição. E como nosso controle positivo, utilizamos o 8-MOP, em que vários trabalhos já o cita por precisar de luz para sua ativação (N. CHEEPTHAM e TOWERS, 2002; EDINARDO et al, 2010; COUTINHO HDM et al, 2009). No entanto, não é possível afirmar qual o
real local de ação da UV-A, ou seja, se ela está agindo diretamente na bactéria, gerando oxigênio singlet, que pode danificar o DNA através de reações fotossensibilizantes indireta (ROJESHWAR, 2010) ou se a UV-A está agindo no produto natural utilizado.
Nenhum extrato foi ativo contra a bactéria Gram-negativa (EC 8539). Vários estudos demonstraram que existe uma diferença na susceptibilidade a antibacteriana mediada por luz entre gram-positiva e as bactérias gram-negativas (MERCHAT et al, 1996; MINNOCK et al, 1996; NITZAN et al, 1992). A fraca atividade antibacteriana mediada por luz contra bactérias Gram-negativas demonstrada na Tabela 3 é atribuída à presença de uma membrana exterior com cadeias de polissacarídeos servindo como uma barreira para compostos ativos (MANN et al, 2000).
Embora se saiba que S. aureus mostra uma susceptibilidade elevada a produtos expostos a luz, os fatores, que regulam a variação na resposta a este tratamento entre as estirpes são desconhecidos (MARIUSZ, 2010).
Atividade Antibacteriana Mediada por Luz UVA Tabela 06. Atividade Antibacteriana mediada por luz dos extratos de algas
UVA - UVA + IS-58 RN- 4220 SA- 1199B ATCC 6538 EC 8539 IS-58 RN- 4220 SA- 1199B ATCC 6538 EC 8539 Gracilária -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Caulerpa Kempifii -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Caulerpa Mexicana -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Condrophycus papillosus -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Sargassum polyceratium (Etanólico) -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- Sargassum polyceratium (Hexânico) -/- -/- /- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- Dictyota pulchella -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ +/+ +/+ -/- DMSO -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 8-MOP -/- -/- -/- -/- -/- ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ DMSO: controle negativo; 8-MOP: controle positivo.
6. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:
Apesar dos extratos, fases e constituintes não apresentarem atividade antibacteriana relevante frente as linhagens de S.
aureus, eles indicaram que são potenciais fontes de adjuvantes de antibióticos,
ou seja, agem como putativos inibidores de bomba de efluxo, modulando ou até revertendo a resistência bacteriana a certos antibióticos (eritromicina e tetraciclina e norfloxacina).
Os extratos de Sargassum polyceratium EtOH, Hexânico e o extratos de Dictyota pulchella (dicloro metano:metanol) apresentaram atividade antibacteriana mediada por Luz UV-A. Mostrando que estes compostos apenas exercem suas atividades antibacterianas desejadas em presença do comprimento de onda ultravioleta UVA (320-400 nm), fornecendo uma razão para o uso desses extratos em novas estratégias antimicrobianas e como ingredientes ativos para certas doenças da pele tais como a psoríase e vitiligo .