GEREÇ VE YÖNTEM
5.1. Olguların D4Z4 Tekrarlarının Değerlendirilmes
Beklenildiği gibi hem aile öyküsü olan hem de FSHD olarak ön tanı almış olgularda klinik özellikleriyle paralel olarak D4Z4 tekrarları hastalığın belirteci olan 1-11 tekrar aralığındadır (Bkz. Tablo 5.1). 1. aileden olan ilk iki olgunun bant uzunluğu yaklaşık 18 kb ( ≈4-5 bant), 2. aileden olan 3. 4. 5. ve 13. 14.olguların bant uzunluğu yaklaşık 30 kb (≈7-8) , 3. aileden 6. ve 7. olguların bant uzunluğu yaklaşık 26 kb (≈6-7) ve 4. aileden 8. 9. 10. 11. ve 12. olguların bant uzunluğu yaklaşık 25 kb (≈6)’dir. Kontrollerde ise 1. kontrolde 49 kb (≈14-15) , 2. kontrolde yaklaşık 65 kb (≈19-20), 3. kontrolde ise yaklaşık 72 kb (≈21-22) bant uzunluğu vardır. (Bak. Tablo 5.2)
28
Tablo 5.1. 14 FSHD’li Olgunun Klinik ve Moleküler Genetik Verileri
Aile No No Cinsiyet/ Yaş Ön Tanı Aile Öyküsü Başlangıç Yaşı Yüz , Kol, Omuz, Bacak Kası Tutulumu Yaklaşık Tekrar Sayısı 1 1 E/50 FSHD + 13 Y,K,O 4-5 2 E/17 FSHD + 13 Y,K,O 4-5 2 3 E/51 FSHD + 13 Y,K,O,B* 7-8 4 E/48 FSHD + 18 Y,K,O,B 7-8 5 K/47 FSHD + 46 Y,K,O,B 7-8 13 K/70 FSHD + 60 Y,K,O,B 7-8 14 K/62 FSHD + 58 Y,K,O,B 7-8 3 6 E/51 FSHD + 13 Y,K,O 6-7 7 K/13 FSHD + 10 Y,K,O 6-7 4 8 E/5 - + 3 Y 6 9 K/25 FSHD + 20 Y,K,O 6 10 E/35 FSHD + 18 Y,K,O,B 6 11 E/31 FSHD + 16 Y,K,O,B 6 12 E/39 FSHD + 18 Y,K,O,B 6
* Tekerlekli sandalyeye bağımlı
Tablo 5.2. 3 Kontrol Bireyin Klinik ve Moleküler Verileri
No Cinsiyet/Yaş Ön Tanı Aile Öyküsü Yaklaşık Tekrar sayısı 1 E/35 - + 14-15 2 K/24 - + 19-20 3 K/25 - - 21-22
29 TARTIŞMA
Fasioskapulohumeral Musküler Distrofi (FSHD) otozomal dominant bir miyopati olup, genel olarak yüz, omuz ve üst kol kaslarını etkilemektedir. 1:20000 insidansla, Duchenne ve Myotonik Distrofi’den sonra en çok karşılaşılan kalıtsal nöromusküler hastalıktır [33, 76].
FSHD hastalığı (FSHD1A, FSHD1), 4 numaralı kromozomun q35 bölgesindeki polimorfik D4Z4 makrosatellitlerinin tekrarlarındaki delesyonlarla karakterizedir [77]. Normal bireyler 11 ile 100 (35-300 kb) arasında, FSHD hastaları ise 1 ile 11 (10-35 kb) D4Z4 ardışık tekrar dizilerine sahiptirler.
FSHD tanılı olgularda D4Z4 tekrar dizilerinde meydana gelen delesyonların moleküler teşhisinde, PCR ve Southern Blot yöntemleri kullanılmaktadır. PCR yöntemi bu hastalığın tanısı için kolay bir yöntemdir, ayrıca kısa zamanda sonuç alınması, nonradyoaktif bir yöntem olması ve az miktarda DNA gerektirmesi Southern blot yöntemine göre avantaj olarak gözükmektedir. Klasik PCR yönteminin dezavantajı ise kısa fragmentler için yüksek çözünürlüğü sağlayamaması ve FSHD bölgesinin yüksek oranda GC içeriği sebebiyle bölgenin sekonder yapısından kaynaklanan denatürasyon problemleridir. Bu bölgenin ileri derecedeki sekonder yapısının daha gevşek yapı kazanmasına yardımcı olmak için denatürasyon sıcaklığının yükseltilmesi, DMSO, Gliserol kullanımıyla bölgenin daha iyi denatüre olması sağlanmaya çalışılmış ve reaksiyon sırasında enzim eklenmesiyle enzim aktivitesinin reaksiyon boyunca korunması sağlanarak fragmentlerin daha iyi gözükebileceği düşünülmüştür; fakat yapılan Long PCR çalışmalarında 5 fragmentin altında olan hastalar için teşhis sağlarken, 5 fragmentin üstünde başarılı olunamamaktadır. Ayrıca proteinlerin ve tuzların iyi uzaklaştırılamamasından kaynaklanan düşük kaliteli DNA, PCR amplifikasyonu için uygun olmamakta ve yanlış sonuç elde edilebilmektedir [9, 78]. Southern blot yöntemi PCR yöntemine nazaran başarılı sonuçlar alınan bir yöntemdir; özellikle kısa fragmentler için yüksek çözünürlüğü sağlaması yönünden avantajlıdır. Dezavantajı ise çok vakit alması, radyoaktif bir yöntem olması, yüksek dikkat ve sabır gerektirmesi ve çok miktarda DNA kullanılmasıdır.
Southern blot yönteminde radyoaktif işaretli prob kullanılmasıyla, iyi sonuçlar alınmasına rağmen, son derece hassas, tehlikeli bir yöntem olması, daha çok zaman harcanmasına neden olması ve aynı zamanda daha çok maddi imkan gerektirmesi nedeniyle nonradyoaktif metodların geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır.
Hollanda’da yapılan ve başarılı sonuçlar alınan radyoaktif çalışmanın ardından Tıbbi Biyoloji ve Genetik laboratuarında, Southern blot yöntemi nonradyoaktif olarak otutturulmaya çalışılmıştır. İlk başta radyoaktif yöntemle birebir EcoRI, HindIII enzim kesimleri yapılmış, elektoroforez yöntemiyle örnekler yürütülerek ve görüntülenerek kesimlerin başarılı olduğu gösterilmiştir. Örneklerin, membrana
30
transferinde bir sorun olmadığı da UV’de görüntüleyerek belirlenmiştir. Tüm Southern blot işlemlerinden sonra Marker görüntülenebilirken, kesim bölgelerine ait herhangi bir bant görüntülenememiştir. Marker’ın görülmesi yapılan işlemlerin başarılı olduğunu ve hazırlanan Southern blot solüsyonlarında bir sorun olmadığını göstermektedir. Probda sorun olabileceği düşüncesiyle, probun antikorla işaretlenip işaretlenmediği ve ne kadar miktar probun yeterli olduğu test edilmiş ve sonuçta probun işaretlendiğine dair sinyaller görüntülenmiş ve net miktarı da belirlenmiştir. Pek çok tekrardan sonra tüm denemelerde başarısız olunmuş, daha sonraki çalışmalarda DNA fragmentlerinin jelden membrana daha etkili bir şekilde transfer olmasını sağlamak için 15 kb’den büyük DNA fragmentlerinin depürinizasyonu ve denatürasyonunu kolaylaştırmak için HCl solüsyonu hazırlanmış ve denatürasyon ve nötralizasyon işlemlerinden önce HCl solüsyonunda bekletilmiştir; fakat tüm çabalara rağmen sonuç elde edilememiştir. Radyoaktif yöntemde bantlar elde edilirken, nonradyoaktif yöntemde hiçbir bant elde edilememesinin sebebinin, radyoaktif yöntemde alınan sinyalin çok kuvvetli, buna karşılık nonradyoaktif yöntemde alınan sinyallerin, zayıf olmasından kaynaklandığını düşündürmektedir. FSHD tanısında D4Z4 fragmentlerinin tanımlanması önemlidir; fakat bu fragmentler 4 nolu kromozom dışında, 10 nolu kromozomun q26 bölgesinde de bulunmaktadır ve 4 nolu kromozoma ait D4Z4 fragmentleriyle %98< homoloji göstermektedir [79]. Bu homolojinin yüksekliğine rağmen 10 nolu kromozom üzerindeki D4Z4 delesyonlarının FSHD hastalığıyla ilişkisi bulunmamıştır [80]. İki bölge orasındaki yüksek homoloji ve dolayısıyla oluşan translokasyonlar FSHD tanısını güçleştirmektedir.
D4Z4 tekrar bölgesi, EcoRI enzimiyle kesilen DNA’yı takiben p13E-11 (D4F104S1) probuyla hibridizasyon sağlanarak Southern blot yöntemiyle görüntülenmektedir. p13E-11 probu 4q35’ten gelen iki alel ve 10q26’dan gelen iki alel olmak üzere toplam 4 EcoRI fragmentini tanımaktadır. 4 numaralı kromozoma ait kısa fragmenti belirlemek için ayrı bir enzim kesimine ihtiyaç vardır. BlnI enzimi sayesinde sadece 4 numaralı kromozoma ait fragmentler görülmekte ve buna ek olarak kesin tanı için XapI enzimiyle kesilerek 10 numaralı kromozoma ait fragmentler görüntülenebilmektedir.
Nonradyoaktif yöntemde yaşanan zorluklar nedeniyle Hollanda’da yapılan çalışma baz alınmış olup bu çalışmamızda her hasta için EcoRI/HindIII kesimi, EcoRI/BlnI çifte enzim kesimi ve XapI enzim kesimi yaptıktan sonra radyoaktif işaretli p13E11 probu kullanarak, 4 ve 10 numaralı kromozomlara ait fragmentleri gösterilmiştir.
Fragment boyutlarına bakarak bizim hastalarımızda 4 ve 10 numaralı kromozomlar arasında translokasyonlar yok gibi görülmekte ve her iki kromozoma da ait iki alel gözükmektedir. FSHD tanısı konulan hastaların kliniğiyle paralel olarak 4 numaralı kromozoma ait fragmentlerden birinin tüm hastalarda 35 kb ‘den kısa olduğu görülmektedir. Ailesinde FSHD hastalığı olan ve olmayan sağlıklı kontrol bireylerde ise yine klinikle paralel olarak 4 numaralı kromozoma ait fragmentin 35 kb’den büyük olduğu gözükmektedir.
Literatüre göre kısa fragmente sahip bireyler daha ağır fenotipe sahip olmaktadır [13]. Bizim çalışmamızda en kısa fragmente sahip aile 1 numaralı ailedir (18 kb);
31
fakat bireylerin fenotipine bakıldığında yüz, omuz ve kol kaslarına ilaveten bacak kaslarının etkilenmiş olması nedeniyle tekerlekli sandaleyeye bağımlı bir profil beklenirken, bu ailede baba oğul 2 hastada da bacaklarda herhangi bir tutulum gözükmemektedir.
2 numaralı ailede klinik fenotipi olan 5 hastadan 3’ü kadın 2’si erkektir. Moleküler analizi sonucunda FSHD profili desteklenen hastaların (30 kb), hastalığın başlangıç yaşı erkeklerde birinci dekattan sonrayken, kadınlarda 4. ve 5. dekattan sonra ortaya çıkmıştır. Bu ailenin profiline bakıldığında, kadınlarda erkeklere oranla daha geç zamanda hastalığın ortaya çıkması ve menopozu takiben hastalık süreci belirgin olarak hızlanıyor olması, menopozla beraber kas gücünde genel olarak bir azalma görülmeye başlamakta olduğu yönündeki literatürlerle uyumludur [49] . 3 numaralı ailede baba-kız aynı klinik özelliklere sahip olup, başlangıç yaşları da cinsiyet farkı göstermemektedir ve hastalık iki olguda da 1. dekattan sonra ortaya çıkmıştır. Moleküler araştırması yapılan bu ailede de kısa fragment (26 kb) gösterilerek klinik özellikler desteklenmektedir. Literatürde aynı aile içerisinde de fragment boyutunun aynı olmasına rağmen epigenetik değişiklikler sonucunda klinik çeşitlilik söz konusu olabilmektedir [81]. Bu ailenin klinik özelliklerine ve aile öyküsüne bakıldığında ortak benzerlikler olmasına rağmen ileriki yaşlarda aradaki fark şu anda tahmin edilememektedir.
Literatürde FSHD hastalığında antisipasyon olduğu, dolayısıyla her nesilde daha ağır fenotipe sahip bireyler ortaya çıkabileceği [39, 82] ve kadınlarda erkeklere nazaran hastalığın daha hafif bulgu verdiği söylenmektedir [37, 82]. Fragment boyutu en kısa ikinci aile olan (25 kb) 4 numaralı ailede erkek bireylerde fenotipin, genel olarak daha ağır seyrettiği görülürken, dişi bireylerde çok daha hafif seyretmektedir. Başlangıç yaşı literatürle paralel olarak 3 erkek bireyde 1. dekattan sonra ortaya çıkmış, dişi bireyde ise 2. dekatta ortaya çıkmıştır. Ailede hastalığın ilk görüldüğü büyükannnenin kliniğinin hafif seyretmesi antisipasyonu akla getirmektedir; çünkü oğulları ve kızı daha ağır etkilenmiş ve genellikle 2. dekattan sonra ortaya çıkması beklenen fenotip; ailenin en küçük bireyinde 3 yaşından itibaren ilk belirtilerden biri olan yüzde mimiklerin kaybolması ile başlamış ve bu bireyin henüz klinik bir tanı almamasına rağmen moleküler araştırma sonucunda FSHD hastası olduğu anlaşılmıştır.
FSHD hastalığı için çalışılan bu 4 ailede fragment boyutları arasında aileler arasında farklılık olmasına rağmen aile içinde D4Z4 kısa fragment boyutunun tüm aile üyelerinde aynı olduğu görülmektedir.
Bu çalışmamızda yer alan 4 aileyi kıyasladığımızda en kısa fragment boyutuna sahip aile 1 numaralı ailedir (18 kb); bireylerin fenotipinin, diğer ailelerle kıyaslandığında beklentinin tersine [13] daha büyük D4Z4 fragmentine sahip 2 ailenin (2 ve 4 numaralı aileler) üyelerinden daha hafif olduğu gözlenmektedir. Çalışmaya dahil edilen ailelerden ayrıntılı hikaye alınarak, fragment boyutu ile klinik fenotip arasında ilişki kurulmaya çalışılmasına rağmen, aynı D4Z4 fragment boyutuna sahip olsa da bireylerin aile içinde bile, yaş ile klinik özelliklerin bağlantısı kurulamamakta ve dolayısıyla aile içinde heterojenite varken aileler arasında FSHD hastalığına ait ortak bir profil bulmak, ortak bir bulgu ortaya koymak çok zordur.
32
Klinik şiddetin farkını ya da benzer özelliklerini gösterebilmek ve tam olarak fragment boyutuyla ilişkisini ve antisipasyon bağlantısını gösterebilmek için bu ailelerin uzun süre takip edilmesi gerekmektedir. Kalan diğer tüm hasta ve normal aile üyelerine ve Türkiye’de FSHD hastalığına sahip daha çok aileye ulaşılarak popülasyon bazlı bir çalışmanın yapılması kaçınılmaz olmuştur. FSHD hala “tedavi edilemez” bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, FSHD konusunda yapılan çalışmalara ülkemizin de katkısını sağlayarak hız kazandırmak gerekmektedir. Bu hastalık üzerine ülkemizde başka herhangi bir moleküler genetik çalışma olmamasından dolayı, daha çok FSHD hastasına ulaşılarak genel bir profil çıkarılması, insidansının belirlenmesi ve istatiksel moleküler verilerin ortaya konulması kaçınılmazdır.
Son yıllarda yapılan çalışmada D4Z4 delesyonları sonucunda kromatin yapısının değişmesi ve histon modifikasyonları sonucu olduğu düşünülen hem tekrar bölgesindeki hem de komşu bölgedeki genlerin ekspresyon seviyelerinin değiştiği gösterilmiştir. Normalde düşük ekspresyon seviyesine sahip FRG1, FRG2, ANT1, TUBB4q genlerinin ve normalde ekspresyonu gözlenmeyen DUX4 geninin FSHD hastalarının kas dokusu alınarak myoblast hücreleriyle yapılan çalışmalarda overeksprese olduğu görülmüştür [12]. FSHD moleküler tanısının konulmasında D4Z4 fragmentleri, epigenetik mekanizma, genlerin susturulması gibi moleküler teknikler üzerine ve özellikle toksik etkisi bilinen DUX4 genine yönelik çalışmaların yapılması ve yöntemlerin geliştirilmesi bu hastalığın mekanizmasını çözmekte avantajlar sağlayacaktır.
Bizim çalışmamızda uyguladığımız Southern blot yöntemi araştırma amaçlı olup rutinde uygulanmamaktadır. Bu yöntemin rutine uygulanması halinde, tekrar sayılarının belirlenmesinde nonradyoaktif yöntemin henüz etkin olmadığı bu nedenle radyoaktif yöntemin uygulanmasının daha yararlı olacağı ve bu sayede ailelere genetik danışma verilebileceği düşüncesindeyiz.
33
KAYNAKLAR
1. Pandya, S., W.M. King, and R. Tawil, Facioscapulohumeral dystrophy. Phys Ther, 2008. 88(1): p. 105-13.
2. Tawil, R. and S.M. Van Der Maarel, Facioscapulohumeral muscular
dystrophy. Muscle Nerve, 2006. 34(1): p. 1-15.
3. van der Kooi, A.J., et al., Extension of the clinical range of
facioscapulohumeral dystrophy: report of six cases. J Neurol Neurosurg
Psychiatry, 2000. 69(1): p. 114-6.
4. Brouwer, O.F., et al., Early onset facioscapulohumeral muscular dystrophy. Muscle Nerve, 1995. 2: p. S67-72.
5. Cabianca, D.S. and D. Gabellini, The cell biology of disease: FSHD: copy
number variations on the theme of muscular dystrophy. J Cell Biol, 2010.
191(6): p. 1049-60.
6. Winokur, S.T., et al., Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)
myoblasts demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.
Neuromuscul Disord, 2003. 13(4): p. 322-33.
7. Padberg, G.W., et al., On the significance of retinal vascular disease and
hearing loss in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Muscle Nerve,
1995. 2: p. S73-80.
8. Grosso, S., et al., Epilepsy, speech delay, and mental retardation in
facioscapulohumeral muscular dystrophy. Eur J Paediatr Neurol, 2011. 15(5):
p. 456-60.
9. Goto, K., I. Nishino, and Y.K. Hayashi, Rapid and accurate diagnosis of
facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neuromuscul Disord, 2006. 16(4):
p. 256-61.
10. Ciafaloni, E., et al., Pregnancy and birth outcomes in women with
facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology, 2006. 67(10): p. 1887-
9.
11. Orrell, R.W., et al., Definitive molecular diagnosis of facioscapulohumeral
dystrophy. Neurology, 1999. 52(9): p. 1822-6.
12. Klooster, R., et al., Comprehensive expression analysis of FSHD candidate
genes at the mRNA and protein level. Eur J Hum Genet, 2009. 17(12): p.
1615-24.
13. Klinge, L., et al., Severe phenotype in infantile facioscapulohumeral
muscular dystrophy. Neuromuscul Disord, 2006. 16(9-10): p. 553-8.
14. van der Maarel, S.M., R.R. Frants, and G.W. Padberg, Facioscapulohumeral
muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta, 2007. 1772(2): p. 186-94.
15. Laforet, P., et al., Cardiac involvement in genetically confirmed
facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology, 1998. 51(5): p. 1454-6.
16. Fisher, J. and M. Upadhyaya, Molecular genetics of facioscapulohumeral
34
17. Kazakov, V.M. and D.I. Rudenko, Clinical variability of facioscapulohumeral muscular dystrophy in Russia. Muscle Nerve, 1995. 2:
p. S85-95.
18. Faber, C.G., M.M. Klaver, and J.H. Wokke, [A winged scapula]. Ned Tijdschr Geneeskd, 2002. 146(37): p. 1717-20.
19. Upadhyaya, M., et al., A genetic linkage study of facioscapulohumeral
(Landouzy-Dejerine) disease with 24 polymorphic DNA probes. J Med Genet,
1989. 26(8): p. 490-3.
20. Wijmenga, C., et al., Location of facioscapulohumeral muscular dystrophy
gene on chromosome 4. Lancet, 1990. 336(8716): p. 651-3.
21. Gilbert, J.R., et al., Evidence for heterogeneity in facioscapulohumeral
muscular dystrophy (FSHD). Am J Hum Genet, 1993. 53(2): p. 401-8.
22. Hewitt, J.E., et al., Analysis of the tandem repeat locus D4Z4 associated with
facioscapulohumeral muscular dystrophy. Hum Mol Genet, 1994. 3(8): p.
1287-95.
23. Lyle, R., et al., The FSHD-associated repeat, D4Z4, is a member of a
dispersed family of homeobox-containing repeats, subsets of which are clustered on the short arms of the acrocentric chromosomes. Genomics,
1995. 28(3): p. 389-97.
24. Jiang, G., et al., Testing the position-effect variegation hypothesis for
facioscapulohumeral muscular dystrophy by analysis of histone modification and gene expression in subtelomeric 4q. Hum Mol Genet, 2003. 12(22): p.
2909-21.
25. van Overveld, P.G., et al., Hypomethylation of D4Z4 in 4q-linked and non-
4q-linked facioscapulohumeral muscular dystrophy. Nat Genet, 2003. 35(4):
p. 315-7.
26. Zeng, W., et al., Specific loss of histone H3 lysine 9 trimethylation and
HP1gamma/cohesin binding at D4Z4 repeats is associated with facioscapulohumeral dystrophy (FSHD). PLoS Genet, 2009. 5(7): p.
e1000559.
27. van der Maarel, S.M., R. Tawil, and S.J. Tapscott, Facioscapulohumeral
muscular dystrophy and DUX4: breaking the silence. Trends Mol Med, 2011.
17(5): p. 252-8.
28. Ottaviani, A., et al., The D4Z4 macrosatellite repeat acts as a CTCF and A-
type lamins-dependent insulator in facio-scapulo-humeral dystrophy. PLoS
Genet, 2009. 5(2): p. e1000394.
29. Deidda, G., et al., Physical mapping evidence for a duplicated region on
chromosome 10qter showing high homology with the facioscapulohumeral muscular dystrophy locus on chromosome 4qter. Eur J Hum Genet, 1995.
3(3): p. 155-67.
30. van Deutekom, J.C., et al., Evidence for subtelomeric exchange of 3.3 kb
tandemly repeated units between chromosomes 4q35 and 10q26: implications for genetic counselling and etiology of FSHD1. Hum Mol Genet, 1996. 5(12):
p. 1997-2003.
31. van der Maarel, S.M., et al., A new dosage test for subtelomeric 4;10
translocations improves conventional diagnosis of facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). J Med Genet, 1999. 36(11): p. 823-8.
35
32. Matsumura, T., et al., Chromosome 4q;10q translocations; comparison with
different ethnic populations and FSHD patients. BMC Neurol, 2002. 2: p. 7.
33. Upadhyaya, M. and D.N. Cooper, Molecular diagnosis of facioscapulohumeral muscular dystrophy. Expert Rev Mol Diagn, 2002. 2(2):
p. 160-71.
34. Upadhyaya, M., et al., Germinal mosaicism in facioscapulohumeral muscular
dystrophy (FSHD). Muscle Nerve, 1995. 2: p. S45-9.
35. Kohler, J., et al., Germline mosaicism in 4q35 facioscapulohumeral muscular
dystrophy (FSHD1A) occurring predominantly in oogenesis. Hum Genet,
1996. 98(4): p. 485-90.
36. van der Maarel, S.M., et al., De novo facioscapulohumeral muscular
dystrophy: frequent somatic mosaicism, sex-dependent phenotype, and the role of mitotic transchromosomal repeat interaction between chromosomes 4 and 10. Am J Hum Genet, 2000. 66(1): p. 26-35.
37. Lunt, P.W., et al., Phenotypic-genotypic correlation will assist genetic
counseling in 4q35-facioscapulohumeral muscular dystrophy. Muscle Nerve,
1995. 2: p. S103-9.
38. Zatz, M., et al., High proportion of new mutations and possible anticipation
in Brazilian facioscapulohumeral muscular dystrophy families. Am J Hum
Genet, 1995. 56(1): p. 99-105.
39. Tawil, R., et al., Evidence for anticipation and association of deletion size
with severity in facioscapulohumeral muscular dystrophy. The FSH-DY Group. Ann Neurol, 1996. 39(6): p. 744-8.
40. Hsu, Y.D., et al., Application of chromosome 4q35-qter marker (pFR-1) for
DNA rearrangement of facioscapulohumeral muscular dystrophy patients in Taiwan. J Neurol Sci, 1997. 149(1): p. 73-9.
41. Funakoshi, M., et al., [Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)]. Nihon Rinsho, 1997. 55(12): p. 3181-5.
42. Miura, K., et al., Two cases of chromosome 4q35-linked early onset
facioscapulohumeral muscular dystrophy with mental retardation and epilepsy. Neuropediatrics, 1998. 29(5): p. 239-41.
43. Butz, M., et al., Facioscapulohumeral muscular dystrophy. Phenotype-
genotype correlation in patients with borderline D4Z4 repeat numbers. J
Neurol, 2003. 250(8): p. 932-7.
44. Upadhyaya, M., M. MacDonald, and D. Ravine, Prenatal diagnosis for
facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). Prenat Diagn, 1999.
19(10): p. 959-65.
45. Gabellini, D., M.R. Green, and R. Tupler, Inappropriate gene activation in
FSHD: a repressor complex binds a chromosomal repeat deleted in dystrophic muscle. Cell, 2002. 110(3): p. 339-48.
46. Tawil, R., et al., Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD): design
of natural history study and results of baseline testing. FSH-DY Group.
Neurology, 1994. 44(3 Pt 1): p. 442-6.
47. Padua, L., et al., Quality of life and pain in patients with facioscapulohumeral
muscular dystrophy. Muscle Nerve, 2009. 40(2): p. 200-5.
48. de Greef, J.C., et al., Clinical features of facioscapulohumeral muscular
36
49. Welle, S., R. Tawil, and C.A. Thornton, Sex-related differences in gene
expression in human skeletal muscle. PLoS One, 2008. 3(1): p. e1385.
50. Deidda, G., et al., Direct detection of 4q35 rearrangements implicated in
facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). J Med Genet, 1996. 33(5):
p. 361-5.
51. Barro, M., et al., Myoblasts from affected and non-affected FSHD muscles
exhibit morphological differentiation defects. J Cell Mol Med, 2010. 14(1-2):
p. 275-89.
52. Cheli, S., et al., Expression profiling of FSHD-1 and FSHD-2 cells during
myogenic differentiation evidences common and distinctive gene dysregulation patterns. PLoS One, 2011. 6(6): p. e20966.
53. Homma, S., et al., A unique library of myogenic cells from
facioscapulohumeral muscular dystrophy subjects and unaffected relatives: family, disease and cell function. Eur J Hum Genet, 2012. 20(4): p. 404-10.
54. van Deutekom, J.C., et al., Search for the FSHD gene using cDNA selection
in a region spanning 100 kb on chromosome 4q35. Muscle Nerve, 1995. 2: p.
S19-26.
55. Gabriels, J., et al., Nucleotide sequence of the partially deleted D4Z4 locus in
a patient with FSHD identifies a putative gene within each 3.3 kb element.
Gene, 1999. 236(1): p. 25-32.
56. Belayew, A., [Functional study of a gene candidate for Landouzy-Dejerine
muscular dystrophy]. Bull Mem Acad R Med Belg, 2004. 159(5-6): p. 343-8;
discussion 348-9.
57. Bosnakovski, D., et al., An isogenetic myoblast expression screen identifies
DUX4-mediated FSHD-associated molecular pathologies. EMBO J, 2008.
27(20): p. 2766-79.
58. Bosnakovski, D., et al., DUX4c, an FSHD candidate gene, interferes with
myogenic regulators and abolishes myoblast differentiation. Exp Neurol,
2008. 214(1): p. 87-96.
59. Dixit, M., et al., DUX4, a candidate gene of facioscapulohumeral muscular
dystrophy, encodes a transcriptional activator of PITX1. Proc Natl Acad Sci
U S A, 2007. 104(46): p. 18157-62.
60. Snider, L., et al., RNA transcripts, miRNA-sized fragments and proteins
produced from D4Z4 units: new candidates for the pathophysiology of facioscapulohumeral dystrophy. Hum Mol Genet, 2009. 18(13): p. 2414-30.
61. Vanderplanck, C., et al., The FSHD atrophic myotube phenotype is caused by
DUX4 expression. PLoS One, 2011. 6(10): p. e26820.
62. Snider, L., et al., Facioscapulohumeral dystrophy: incomplete suppression of
a retrotransposed gene. PLoS Genet, 2010. 6(10): p. e1001181.
63. Tsumagari, K., et al., Gene expression during normal and FSHD myogenesis. BMC Med Genomics, 2011. 4: p. 67.
64. Darabi, R., et al., Engraftment of embryonic stem cell-derived myogenic
progenitors in a dominant model of muscular dystrophy. Exp Neurol, 2009.
220(1): p. 212-6.
65. Engelkamp, D. and V. van Heyningen, Transcription factors in disease. Curr Opin Genet Dev, 1996. 6(3): p. 334-42.
37
66. van Geel, M., et al., Identification of a novel beta-tubulin subfamily with one
member (TUBB4Q) located near the telomere of chromosome region 4q35.
Cytogenet Cell Genet, 2000. 88(3-4): p. 316-21.
67. Bedell, M.A., N.G. Copeland, and N.A. Jenkins, Multiple pathways for Steel
regulation suggested by genomic and sequence analysis of the murine Steel gene. Genetics, 1996. 142(3): p. 927-34.
68. Lemmers, R.J., et al., D4F104S1 deletion in facioscapulohumeral muscular
dystrophy: phenotype, size, and detection. Neurology, 2003. 61(2): p. 178-83.
69. Doerner, A., et al., Tissue-specific transcription pattern of the adenine
nucleotide translocase isoforms in humans. FEBS Lett, 1997. 414(2): p. 258-
62.
70. Stepien, G., et al., Differential expression of adenine nucleotide translocator
isoforms in mammalian tissues and during muscle cell differentiation. J Biol
Chem, 1992. 267(21): p. 14592-7.
71. Li, K., et al., A human muscle adenine nucleotide translocator gene has four
exons, is located on chromosome 4, and is differentially expressed. J Biol
Chem, 1989. 264(24): p. 13998-4004.
72. Hudgson, P., W.G. Bradley, and M. Jenkison, Familial "mitochondrial"
myopathy. A myopathy associated with disordered oxidative metabolism in muscle fibres. 1. Clinical, electrophysiological and pathological findings. J
Neurol Sci, 1972. 16(3): p. 343-70.
73. Slipetz, D.M., et al., Deficiency of complex III of the mitochondrial
respiratory chain in a patient with facioscapulohumeral disease. Am J Hum
Genet, 1991. 48(3): p. 502-10.
74. Haraguchi, Y., et al., Genetic mapping of human heart-skeletal muscle
adenine nucleotide translocator and its relationship to the facioscapulohumeral muscular dystrophy locus. Genomics, 1993. 16(2): p.
479-85.
75. Sandri, M., et al., Caspase 3 expression correlates with skeletal muscle
apoptosis in Duchenne and facioscapulo human muscular dystrophy. A potential target for pharmacological treatment? J Neuropathol Exp Neurol,
2001. 60(3): p. 302-12.
76. Tawil, R., Facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurotherapeutics, 2008. 5(4): p. 601-6.
77. Wijmenga, C., et al., Genetic linkage map of facioscapulohumeral muscular
dystrophy and five polymorphic loci on chromosome 4q35-qter. Am J Hum
Genet, 1992. 51(2): p. 411-5.
78. Ki, C.S., et al., Clinical and genetic analysis of Korean patients with
facioscapulohumeral muscular dystrophy. J Korean Med Sci, 2008. 23(6): p.
959-63.
79. van Geel, M., et al., Genomic analysis of human chromosome 10q and 4q
telomeres suggests a common origin. Genomics, 2002. 79(2): p. 210-7.
80. Tsumagari, K., et al., FSH dystrophy and a subtelomeric 4q haplotype: a new