M İ HNET KE Ş AN’DA GELENEKSEL MODERN AYRIM
B. Olay Örgüsü:
MATERIAL E MÉTODO
Após a análise dos resultados de caracterização dos compósitos, empregou- se apenas o biomaterial desenvolvido na concentração de CB/FB 50% nestes ensaios, pois foi o que apresentou o melhor desempenho físico-químico, no que tange aos parâmetros avaliados.
No presente estudo as análises in vitro realizadas foram: MTT, azul de tripano, bem como adesão e proliferação celular. Estas foram realizadas em cooperação com o Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz – Fiocruz, Salvador-BA, sob a supervisão da Dra. Camila Indiani e Dra. Valéria de Matos Borges, com o auxílio da aluna de mestrado Fabiana Celes.
As análises de citotoxicidade, são de grande importância, pois fornecem dados sobre a ação da substância testada e as possíveis reações aos tecidos. A citotoxicidade pode ser avaliada por diferentes métodos de acordo com o dano celular ocorrido: alterações nas membranas plasmáticas (podem ser avaliadas por meio de corantes como o azul de tripano), alterações nas funções metabólicas das mitocôndrias, que pode ser mensurado por um método colorimétrico, como o MTT (tetrazólio de 3 - (4,5 - dimetiltiazol -2-il) -2,5-difenil tetrazólio brometo) (Kim et al.51, 2009).
Deste modo, o ensaio de citotoxicidade requer uma selecção do método baseado na adequação da célula empregada nos testes. O presente estudo utilizou as células L929 para os testes de MTT e também para os demais testes, o que está de acordo as normas ISO 10993-5:200945, que baliza os testes in vitro de citotoxicidade
para dispositivos biomédicos. Os testes foram feitos por meio de três repetições independentes.
Para cada ensaio in vitro, foram estabelecidas as seguintes hipóteses: H0: O material desenvolvido responde de maneira semelhante ao controle Scaffold de CB pura e H1: O material desenvolvido responde de maneira diferente do controle Scaffold de CB pura. Para estes ensaios, o teste estatístico empregado foi o de Kruskal Wallis (pois os dados não são paramétricos) empregado o programa estatístico Graph Pad Prism 5.0.
4.3.1 Preparo do material
Os scaffolds dos materiais testados foram preparados sendo imersos em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM - Invitrogen) na quantidade suficiente para cobrir as superfícies dos mesmos, em palcas de petri e foram deixados no fluxo por 1h (Figura 19).
Figura 19 - Tratamento inicial do material no meio DMEM (reidratação). Araraquara,
4.3.2 MTT (Roche Molecular Biochemicals)
Este teste baseia-se na metabolização do MTT pelas mitocôndrias de células viáveis, que irá liberar a enzima succinato desidrogenase, capaz de converter o sal do tetrazolium, de cor amarelada em cristais de Formazan, de cor azul escura/ roxa. O sal de tetrazolium é insolúvel em solução aquosa e pode ser solubilizado em substâncias como o Dimetilsulfóxido (DMSO – (CH3)SO) ou Duodecilsulfato de sódio (SDS) e
quantificado usando um espectrofotômetro. A quantidade de células viáveis correlaciona-se diretamente com a quantidade de formazam formado.
Neste teste, em fluxo laminar, foram semeadas 5.000 (5.103) células L929 em placas de 48 poços num volume de 500 µl de meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM - InvitrogenTM) suplementado com 10% de SFB e 100 U/mL penicilina, 100
µg/mL estreptomicina. As placas com as células foram e incubadas a 37ºC em estufa de 5% de CO2, por 1 h.
Na sequência, foi retirada a placa de 48 poços da estufa já com as células e foi colocado um disco de aproximadamente 0,8 cm de diâmetro de cada biomaterial em cada poço, além do controle negativo (CN = sem biomaterial) e do controle positivo (CP) (metanol), levando novamente para serem incubadas a 37ºC em estufa de 5% de CO2, por 48h. Todos os tratamentos, os CN e CP foram realizados em quintuplicata e em condições de esterelidade (Figuras 20 e 21).
Figura 20 – Esquema da colocação dos materias para a realização do teste. Araraquara, 2014.
CB CB/FB
Meio (CN = Sem bio material) Metanol (CP)
Figura 21 - Placa de 48 poços preparada para o teste de MTT, em quintuplicata. Araraquara, 2014.
Ao final do período de incubação, os biomateriais foram removidos de cada poço e as culturas foram lavadas com 250 µl de soro fisiológico. A luz do fluxo foi apagada e foi colocado em cada poço 200 µl de meio DEMEN (InvitrogenTM) com
solução MTT (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) na concentração final de 500 µg/ml por poço deixando a 37ºC na estufa por um tempo de incubação (tratamento) de 4h (Figura 22).
Figura 22 - a) Scaffolds removidos dos poços após incubação e b) Filtragem do tetrazolium para ser inserido nas culturas. Araraquara, 2014.
Em seguida, foi realizada a leitura colorimétrica em espectrofotômetro Espectra Max 190 (Molecular Devices) em 570 nm e 690 nm, cujo resultado é uma
medida de Densidade Óptica (DO). Quanto mais escura a coloração, maior a metabolização do MTT, consequentemente, maior a DO, e menos citotóxico é o material testado.
4.3.3 Ensaio de Citotoxicidade por meio do Azul de Tripano
A mesma metodologia do MTT foi empregada para o azul de Tripano. Contudo, este teste foi realizado em quadruplicata (Figura 23) e a porcentagem de células viáveis foi determinada contando-se 200 células em pelo menos 5 campos aleatórios no microscópio de luz invertida na presença do azul de tripano ( 50 µl ). O Azul de Tripano age evidenciando as células vivas das mortas, pois a membrana citoplasmática das células mortas se rompem, permitindo a entrada deste líquido, corando as mesmas de azul. O teste foi feito em quadruplicata.
Figura 23 – Esquema demonstrando o teste do azul de tripano, em quadruplicata. Araraquara, 2014.
4.3.4 Ensaio de Adesão, Proliferação e Viabilidade celular
Foram semeadas 5.000 (5.103) células L929 em placas de 48 poços num volume de 500 µl de meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM - InvitrogenTM)
suplementado com 10% de SFB e 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL estreptomicina. As células foram incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2. Foram realizados os
CB CB/FB
Meio (CN = Sem bio material) Metanol (CP)
tratamentos nos seguintes tempos experimentais: 16, 24, 48 e 72 horas, colocando-se um disco de aproximadamente 0,8 cm de diâmetro de cada biomaterial nos poços para permanecerem em contato com as células.
Após os respectivos tempos, as células foram removidas dos poços com trypsina-EDTA 0,25% V/V (GIBCO), centrifugadas a 1300 g 40C por 10 minutos e em
seguida resuspendidas em 20 µl de azul de tripano e contadas em uma câmara hemocitométrica de Neubauer (NewOptic). Todos os tratamentos foram realizados em quadruplicata (Figuras 24 e 25).
Figura 24 - Esquema adotado para o teste de proliferação celular. Araraquara, 2014.
Figura 25 - a) Placa de 48 poços com as células e b)câmara de Neubauer. Araraquara, 2014. 16 h 24h 48h 72h CB CB/FB
a
b
4.3.5 Avaliação por meio de MEV da face superficial do scaffold
Os scaffolds referentes ao tempo de 48 horas receberam tratamento de uma solução de glutaraldeído grau II a 2.5%, formaldeído 2%, e 2.5 mM CaCl2 em 0.1 M
de solução tampão de cacodilato de sódio (pH 7) para fixar as células. Após este procedimento, as amostras foram preparadas com carbono em pó sobre a superfície para serem avaliadas quanto à adesão celular após 48 horas.
RESULTADO
a) MTT (Roche Molecular Biochemicals)
Ao final do tratamento, os biomateriais foram removidos dos poços e a Figura 26 demonstra o aspecto das células viáveis após o contato com o sal do MTT (para termos de ilustração) e do controle negativo em contato com o metanol, visualizado em microscópio óptico de luz invertida, em um aumento de 40x.
Figura 26 – Imagem obtida empregando-se microscópio de luz invertida do aspecto das
célualas em contato com o sal tetrazolium do MTT a) células viáveis e b) metanol, como controle negativo. Araraquara, 2014.
A leitura colorimétrica foi feita, de acordo com a metodologia descrita. Os resultados obtidos estão expressos nas Tabelas 5, 6 e Gráfico 1.
Tabela 5 - Valores obtidos na leitura da densidade óptica (DO) para o teste de viabilidade, empregando o MTT. Araraquara, 2014.
amostra Medium (A) BC (B) BC/SF (C) Methanol (D)
1 0,057 0,038 0,047 0,0 2 0,047 0,045 0,060 0,0 3 0,064 0,049 0,055 0,0 4 0,047 0,049 0,067 0,0 5 0,046 0,052 0,083 0,0
Tabela 6 - Viabilidade por MTT (grupo/meio), expressa em porcentagem (%).Araraquara, 2014. amostra 100 (A / A) 100 (B / A) 100 (C / A) 100 (D / A) 1 100 66,67 82,46 0 2 100 95,74 127,66 0 3 100 76,56 85,94 0 4 100 104,26 142,55 0 5 100 113,04 180,43 0
Gráfico 1 - Viabilidade por MTT (grupo/meio), expressa em porcentagem (%). Araraquara, 2014.
De acordo com os resultados obtidos, os grupos B e C não apresentam citotoxicidade, pois as médias de viabilidade celular encontram-se acima 70%
(B=91,25% e C=123,81% , respectivamente), conforme ditam os padrões da ISO 10993-5:200945.
Contudo, não encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos testados, (p = 0,43). Ou seja, deve-se aceitar a H0 formulada: o nanocompósito (CB/FB 50%) responde de maneira igual aos outros grupos comparados, apesar de sua média de viabilidade (C=123,81% ) apresentar-se maior do que a média obtida para o grupo CB pura (B=91,25%).
b) Ensaio de citotoxicidade por meio do Azul de tripano
Os resultados estão descritos abaixo, na Tabela 7 e Gráfico 2.
Tabela 7 - Média de células vivas (em 200) contadas em microscópio de luz invertida, em 5 campos aleatórios. Araraquara, 2014.
amostra Meio CB CB/FB Metanol
1 145 122 185 0 2 146 153 189 0 3 107 151 180 0 4 126 144 179 0
Gráfico 2 - Viabilidade do Azul de tripano expressos em porcentagem (%). Araraquara, 2014.
Para estes ensaios, o teste estatístico aplicado também foi o de Kruskal Wallis e foi feito o pós teste de Dunns para comparar os grupos, empregando o programa estatístico Graph Pad Prism 5.0. Deste modo, encontrou-se diferença estatísticamente significante apontando para o grupo CB/FB, no valor de p=0,02.
c) Ensaio de adesão e proliferação celular
Os resultados obtidos estão expressos nas Tabelas 8 e 9.
Tabela 8 - Contagem de células após os tempos definidos 16, 24, 48 e 72h, usando câmara hemocitométrica de Neubauer, expressos em nº células/ml, para CB e CB/FB. Araraquara, 2014. amostra CB 16h CB/FB 16h CB 24h CB/FB 24h CB 48h CB/FB 48h CB 72h CB/FB 72h 1 17000 69000 76000 109000 73000 76000 74000 398000 2 16000 16000 88000 70000 86000 55000 32000 48000 3 36000 27000 26000 97000 31000 247000 38000 36000 4 37000 14000 58000 75000 133000 86000 281000 125000
Tabela 9 - Médias e erro padrão das amostras de CB e CB/FB. Araraquara, 2014.
Média (CB) Desvio padrão
(CB) Média (CB/FB) desvio padrão (CB/FB) 16h 26500 5781 31500 12823 24h 62000 13491 87750 9196 48h 80750 21001 116000 44142 72h 106250 58984 151750 84418
Gráfico 3 - Média e desvio padrão em relação aos valores obtidos para a proliferação celular nos tempos definidos 16, 24, 48 e 72h, para CB e CB/FB. Araraquara, 2014.
Para estes ensaios, foi empregado o teste Mann Whitney, que é um teste não paramétrico de comparação entre as médias calculadas empregando o programa estatístico Graph Pad Prism 5.0. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos p<0,05 (p=0,07).
A hipótese de que a fibroína aumenta a adesão celular nos scaffolds de celulose foi testada. Células L-929 foram semeadas sobre CB pura e nos compósitos CB-FB e permaneceram incubadas por 48h. Após aplicar o teste estatístico Mann Whitney, empregando o programa estatístico Graph Pad Prism 5.0, foi encontrado um valor de p<0,05. O Gráfico 4 demonstra os resultados obtidos.
Horas em exposição
Cé
lu
la
Gráfico 4 - Gráfico quantitativo da adesão celular (células L-929) após semeadura sobre os materiais CB e CB-FB 50%. Após 48h, as células foram suspensas e contadas em uma câmera de Newbawer. Cada barra representa a média ± SEM de 3 repetições e é obtida a partir de duas experiências independentes (*p=0,04).Araraquara, 2014.
d) Avaliação por meio do MEV da superfície do scaffold
Os scaffolds utilizados para o ensaio de adesão descrito acima, foram fixados, conforme descrito na metodologia, e a superfície foi avaliada por meio de imagens de MEV (Figura 27).
Nestas imagens é possível visualizar um número muito maior de células aderidas ao scaffold CB-FB. As células apresentam um formato mais estrelado, apresentando pseudópodos como se estivesse se esticando. Este fato é interessante pois indica que as células estão aderindo e proliferando sobre os scaffold. Já nas imagens relativas aos scaffolds de CB pura, as células mantêm um formato mais arredondado, indicando pouca adesão e proliferação celular. Estes dados sugerem que o compósito CB-FB exibe uma melhor biocompatibilidade em comparação à CB puro, devido à presença da FB, que possivelmante induziu um aumento significativo na adesão de fibroblastos L929 no compósito CB-FB 50% em relação à celulose pura.
CB CB/FB
Cé
lu
la
Figura 27 - Imagens de MEV após a adesão das células L-929 por 48 h, em a) CB pura e b) do compósito CB-FB 50%. Araraquara, 2014.
a
5 DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi o de desenvolver um biomaterial para reparação tecidual almejando aplicações em odontologia (em tecido gengival, mucoso, pulpar e ósseo).
Idealmente, um biomaterial deve apresentar as seguintes características: ser biocompatível, isto é, não induzir a respostas teciduais ou imunológicas adversas; não ser tóxico ou carcinogênico; ser quimicamente projetado para suas funções de uso; possuir estabilidade mecânica, peso e densidade ao seu adequados uso; ser esterelizável; ter custo relativamente baixo; ser reprodutível e de fácil fabricação e estimular reações biológicas favoráveis em relação a sua função de uso (Williams98, 2009).
Sobre a resistência mecânica, autores afirmam que a CB apresente esta propriedade com excelência (Klemm et al.55, 2005) e que o desenvolvimento de
compósitos baseados em CB são governados pela natureza de reforçá-los de acordo com a aplicação desejada, no intuido de superar as suas limitações e ampliar as propriedades da CB pura (Shah84, 2013).
As limitações apresentadas pela CB são conhecidas: ela não é facilmente absorvível e também, ao ser excretada pela bactéria Glucanoacetobacter xylinum forma uma densa rede de fibras, o que pode impedir ou diminuir a adesão celular (Backdahl et al.4, 2006) além de não possuir propriedades antibacterianas, apenas funcionar como
uma barreira física contra infecções (Czaja et al.24, 2007). Neste ponto, a fibroína apresenta efeito antimicrobiano (Li et al.63, 2001) o que poderia agregar mais aplicações
e propriedades aos scaffolds de CB/FB concebidos.
Sobre a biodegradabilidade, autores sugerem que a CB apresenta tais propriedades, sendo altamente absorvível (Czaja et al.24, 2007; Williams98, 2009).
Contudo, este processo de degradação da celulose geralmente ocorre na sua forma mais rústica na natureza, por meio de enzimólise, e não no corpo humano onde estas enzimas que degradam a celulose não estão presentes (Hu, Catchmark42-43, 2011). Assim, a
adição de fibroína contribuiria neste quesito para a fabricação de dispositivos bioabsorvíveis, pois esta apresenta um controle de biodegradabilidade sendo altamente absorvível (Ge et al.34, 2012). Esta biodegradabilidade é desejável, já que o ideal é que o
material implantado degrade aos poucos, à medida que o novo tecido vai sendo substituído.
Quanto à adesão celular aos dispositivos biomédicos, ela pode ser melhorada empregando-se sequências de aminoácidos tais como Arg-Gly-Asp (RGD), encontrado em diversas matrizes extracelulares (Fu et al.33, 2013). A literatura
demonstra que a fibroína, uma proteína natural, apresenta estes aminoácidos alcalinos que são conhecidos por serem receptores celulares e mediarem importantes interações entre células de mamíferos e a matrix extra-celular (MEC), facilitando a adesão e crescimento celular (Fang et al.31, 2009). Este fato corrobora com os achados do estudo
realizado ao se examinar as imagens obtidas por meio do MEV, onde é possível visualizar uma maior número de células aderidas aso scaffolds de CB/FB50% quando comparados aos de CB pura (Figura 27).
Outros autores ainda relatam que estes tipos de proteínas exibem ótimas propriedades mecânicas e que combinadas com a biocompatibilidade, oferecem uma importante opção no campo de liberação controlada e engenharia tecidual (Nogueira et al.71, 2009). Deste modo, a adição de FB à CB poderia também conferir estas
propriedades ao material concebido neste estudo, indicando a necessidade de outros estudos específicos para tanto o que não configurou o objetivo desta pesquisa.
Além desta biocompatibilidade tecidual a quase todos os tipos de células (Altman et al.1, 2003; Fang et al.31, 2009), a fibroína ainda apresenta propriedades antitrombogênicas (Ge et al.34, 2012), evitando que sejam formados trombos, ou
agragações plaquetárias no interior dos vasos sanguíneos. Assim, diversos estudos visando o uso deste material como scaffolds na desafiante reconstrução de vasos de calibres inferiores a 5mm tem sido realizados, tanto in vivo quanto in vitro (Marelli et al.68, 2010; Yang et al.100, 2009; Enomoto et al.28, 2010; Unger et al.93, 2010; Patra et al.73, 2012).
No que tange a extração da fibroína, todo o processo seguido encontra-se citado na metodologia deste trabalho (Rocwood et al.77, 2011). Este procedimento faz-se
necessário pois as fibras da seda são compostas por 2 tipos de proteína: a sericina e a fibroína. A sericina é a proteína que parece uma “cola” unindo as fibras da seda e proporcionando a estruturação do casulo. Contudo ela é a responsável pela reação tecidual que as primeiras suturas feitas à base de fios de seda provocavam (Altman et al.1, 2003). Dete modo, deve-se remover a sericina dos casulos do bicho-da-seda, sendo
esta desprezada no processo, para permanecer apenas com a fibroína.
Quanto a rotina de obtenção e características das mantas de CB pudemos observar que a sua produção é relativamente fácil e reprodutível. Contudo, o processo de biofabricação da celulose bacteriana pode ser manipulado de forma a alterar a estrutura e qualidade da mesma, principalmente quanto à fonte de carbono e os aditivos do meio de cultura (Klemm et al.55, 2005). Devido a este fator, o estudo morfológico da CB pura foi conduzido para averiguar a uniformidade das mantas, o que pode influenciar na padronização do biomaterial a ser produzido.
As mantas obtidas neste estudo obedeceram ao padrão de espessura de 95,05 mm de diâmetro e 1,6 mm em média para a manta úmida em 96 horas de crescimento, apresentando 2,25% de massa seca e produção de 1,13g/L, e ainda, em torno de 99% de água, de acordo com Barud et al.9 (2011). Através da análise dos parâmetros avaliados, todos estão coerentes com os dados dos Laboratórios de Materiais Fotônicos (LAMF) em que a CB foi produzida. E para manter a padronização do material, utilizou-se o perfurador pré-fabricado de diâmetro de 8 mm para perfurar as mantas uniformemente.
Então, procedeu-se com a caracterização do material em todas as concentrações obtidas: 25%, 50% e 75% de FB. Os achados foram preliminarmente discutidos juntamente com a exposição dos resultados, de maneira individual nos tópicos de cada técnica. Contudo, de uma forma geral, a adição de fibroína à CB não alterou as características desta.
As imagens obtidas por meio do MEV demonstram que foi possível observar distintamente as fibras da celulose e da fibroína, fato que caracteriza um compósito. Também verificou-se que o material conservou a porosidade, caraterística importante para promover a adesão e crescimento celular (Figura 18). E no compósito de 75% de FB, esta recobriu quase que totalmente as fibras da CB, parecendo uma massa, obliterando os poros totalmente.
Neste ponto vale a pena ressaltar que os benefícios da fibroína quanto à melhora na adesão celular, devido às suas características protéicas, são desejáveis. Contudo, na concentração de 75%, há nitidamente uma diminuição dos poros, indicando que a fibroína pode influenciar no controle do diâmetro destes. Ou seja, não é apenas a quantidade ou qualidade de uma substância adicionada à CB que irá melhorar a adesão
celular, mas também a arquitetura destes scaffolds. Estudos (Bodin et al.13, 2010)
demonstraram que a porosidade induzida em scaffolds de CB pura melhorou a adesão de células tronco derivadas do sitema urinário.
A análise dos espectros obtidos pela espectroscopia FTIR (figura 15) revelou que não ocorreram ligações covalentes entre os dois materias (FB e CB), apenas pontes de hidrogênio, e que tanto as bandas características da celulose quanto da fibroína estão presentes nas regiões típicas e esperadas, não sofrendo modificações. Este fato ressalta o observado nas imagens obtidas por meio do MEV, que não foi produzido um novo material e sim um compósito, onde é possível observar os dois materiais distintamente.
A difratometria de Raios-X indicou uma pequena alteração da cristalinidade, com a adição da FB, deixando o material com características um pouco mais amorfas. Contudo, o fato de o material ter perdido um pouco da transparência não afetará a aplicação em regeneração tecidual para o qual foi concebido.
Em relação à análise térmica (TGA-TG), a fibroína degrada em uma temperatura menor do que a celulose, sendo esta mais resistente ao calor. Contudo, nos compósitos com a celulose, a temperatura de degradação da fibroína foi influenciada pela presença da celulose, e aumentou em torno de 24,4ºC, em média. Estes resultados evidenciados pela TGA-TG em relação à resistência à degradação indicam que o material suporta altas temperaturas e são fundamentais pois, visando aplicações futuras dos dispositivos desenvolvidos neste estudo na área biomédica e odontológica, faz-se necessária a esterelização efetiva do material.
Deste modo, um estudo de 2013 realizado por George et al.35 compara 3
70% por 1 hora, em autoclave a 134 °C e 216 kPa por 12 minutos e radiação-gamma na dose de 15 KGy. Após a esterilização, as amostras foram submetidas a testes físicos, mecânicos e químicos, além de verificar se houve qualquer influência na adesão de células provenientes da córnea humana. Os compósitos de CB/FB desenvolvidos neste estudo suportariam a temperatura da autoclave de 134ºC sem degradar pois as curvas TGA-TG indicam picos de degradação à partir de 280ºC para a FB pura e 373,7ºC para a CB pura desenvolvido, permanecendo os valors dos compósitos entre estes. Entretanto, os resultados encontrados pelos pesquisadores (George et al.35, 2013)
sugerem que método com o melhor desempenho, que causou menor dano e alteração nos materiais foi o de raios gamma.
De maneira semelhante, Hofmann et al.39 (2014) também testaram métodos
de esterelização para scaffolds baseados em FB. Além dos métodos comparados no estudo citado anteriormente, esta pesquisa também avaliou o desempenho da autoclave seca, sob aquecimento de 180ºC, Óxido de Etileno e spray antibiótico antisséptico. As amostras também foram caracterizadas estruturalmente, avaliadas por meio de micro- CT e também quanto a adesão de células tronco mesenquimais. Os resultados indicaram