Numunelerin Alımı ve Analizi

Deneyler önce metal içeriği doğal sulakalana benzer sentetik su kullanılarak E. amazonicus,

C. thaianum, A. congensis ve C. undulata bitkileri ile yürütülmüştür.

İlk dört denemede kullanılan besleme suyundan farklı metal içeriği olan sentetik besleme suyu hazırlanmıştır. Bu yeni besleme suyu ile C. undulata ve M. verticillatum L. bitkileri ile çalışma sürdürülmüştür.

3.5.1 Numunelerin Alımı

Denemelerde, doğal ortamdan alınan sediment yaklaşık 5 cm kalınlığında reaktöre (Şekil 3.11) konduktan sonra, reaktör sentetik su ile doldurulmuş ve bitkiler ekilmiştir. Bu işlemler her deney seti için farklı olmakla beraber 10 dakikadan kısa sürmüştür. Başlangıçta geçen bu süre sonunda alınan ilk giriş ve çıkış suyu ile sediment numunelerinin deneme başlangıcını (t=0) temsil ettiği kabul edilerek analiz sonuçları değerlendirilmiştir.

3.5.1.1 Su, Sediment Arası Boşluk Suyu Ve Sediment Numunelerinin Alımı

Su, sediment arası boşluk suyu ve sediment yapıdaki element kalitesindeki değişimin izelenmesi için bu üç yapıdan numuneler alınarak analizler yapılmıştır.

Su numuneleri reaktörlerin giriş savak kısmından ve çıkış savağına en yakın üst bölgesinden olacak şekilde iki yerden alınmıştır.

Sediment örnekleri ise reaktöre ekilen bitkilerin kök bölgelerine (rizosfer) yakın bölümden alınmıştır.

Alınan sediment örneklerinin 2000 rpm’de 10 dk santirfüjleme (Centrurion 4000 r) işlemine tabi tutulması sonucunda sediment içine hapsolan sediment arası boşluk suyu elde edilmiştir.

3.5.1.2 Bitki Örneklerinin Alımı ve Hazırlanması

Her deney setinin başlangıcı ve deney tamamlandıktan sonra, reaktörden alınan bitkilerin kök, gövde ve yapraklarının boyu ölçülmüştür.

Deney başlanmadan (deneme öncesi) ve deneysel çalışmanın sonrasında (deneme sonrası) her bitkinin organ boyları ayrı ayrı ölçülmüştür. Boy ölçümü yapılan bitki örnekleri, reaktörden çıkarılırken ve deneme esnasında bitki yüzeyine tutunabilecek partiküllerden temizlenmesi için su ve %3’lük HCl ile yıkanmıştır. Bitkilerdeki metal miktarları kuru ağılık üzerinden değerlendirilmektedir. Bu nedenle, bitki örnekleri 60-80 °C’de kurutulduktan sonra oda sıcaklığına gelmesi beklenmiş, daha sonra kök, gövde, yaprak gibi organlara ayrılarak asitle parçalama işlemi yapılmıştır.

3.5.2 Analiz Yöntemi

Su, sediment arası boşluk suyu ve sediment numunelerinde yapılan analiz yöntemeleri ile bitkide uygulanan analiz yöntemleri hakkında bilgiler bu bölümde verilmiştir.

3.5.2.1 Su, Sediment Arası Boşluk Suyu ve Sediment Numunelerinin Analizi

Deneyler aynı tip bitkilerle yaklaşık bir buçuk ay süre sürdürülmüştür. Her denemenin deneme süresi içinde alınan su numunelerinde günlük olarak iletkenlik, tuzluluk, çözünmüş oksijen, pH ve alkalinite ölçülmüştür.

toplam kimyasal oksijen ihtiyacı (TKOİ), Toplam Kjeldal Azotu (TKN) ve Toplam Fosfor (TP) analizleri de yapılmıştır.

Alkalinite (titrimetrik yöntem), TKOİ (açık yöntem), TKN (Macro- Kjeldahl yöntem), TP (persulfate ile ayrıştırma yöntemi) analizleri standart metotlara (APHA,1995) göre; pH (WTW-pH 330i/SET), oksijen (WTW-Oxi 330i/SET), iletkenlik (WTW-Cond 330i/SET), tuzluluk (WTW-Cond 330i/SET), sıcaklık değerleri yerinde ölçüm cihazları ile ölçülmüştür. Marmara Üniversitesi’ndeki HACK Spektrofotometresi ile orto-fosfat ve sülfat, Agilent Chem-station Spektrofotometresi ile nitrat konsantrasyonları ölçülmüştür. Her analizden önce kullanılan aletler kendi standartları ile kalibre edilmiştir.

Sediment örnekleri 2000 rpm’de 10 dk santirfüjleme işlemine tabi tutulup, sediment arası boşluk suyu elde edilmiştir.

Su, sediment arası boşluk suyu ve sedimentte artan zaman dilimleriyle örnekler alınmıştır. Alınan örnekler ağır metal analizi için alt kısımda açıklanan parçalama işlemine tabi tutulmuştur.

Su ve sediment arası boşluk suyu numunelerinde ise 10 ml örnek alınarak 3 ml konsantre HNO3 ilave edilerek kabın ağzı saat camı ile kapatılarak ısıtıcıya konulmuştur. 5 ml numune kalana kadar buharlaşması sağlandıktan sonra numune soğutulmuş 3 ml daha konsantre HNO3 ilave edilmiştir. Son çözeltide 10 ml/100 ml 1:1 HCl’i geçmeyecek biçimde eklendikten sonra ılık ısıtıcının üzerinde 15 dk tutulmuştur. Saat camı ve kap çift distile saf su ile yıkanarak tüm numunenin filitre kağıdından (Schleicher & Schuell Blau band 589/3) geçmesi sağlanmıştır. Parçalanan örnekler daha sonra 100 ml’ye tamamlanmıştır (EPA 3010 Methodu).

Sediment örneklerinin asitle parçalanma işleminde, 1 g ıslak ağırlık alınan numune ve 10 ml lik 1:1 HNO3 ilave edilmiştir. Numune kabının üstü saat camı ile kapatılarak 95 0C de 10 dk ile 15 dk arasında ısıtıcıda kaynamadan tutulmuştur. Örnek soğutulduktan sonra 5 ml konsantre HNO3 ilave edilerek 30 dk lık işleme tabi tutulmuştur. Daha sonra numunenin kaynatılmadan buharlaştırılarak 5 ml kalması sağlanmıştır. Numuneler soğutulduktan sonra 2 ml çift distile saf su ve 3 ml H2O2 (%30) ilave edilerek ısıtıcıya tekrar yerleştirilmiştir. Isıtıcıdan alınan örneklere 5 ml konsantre HCl ve 10 ml çift distile saf su ilave edilip ağzı kapatılarak tekrardan ısıtıcıya konulmuştur. Parçalanan örnekler filitre kağıdından (Schleicher & Schuell Blau band 589/3) geçirildikten sonra 100 ml ye tamamlanıp, ölçüme kadar ışık geçirmeyen bir ortamda ve oda sıcaklığında saklanmıştır (EPA 3050 Methodu).

Asitle parçalanmış ve analize hazırlanmış olan su, sediment arası boşluk suyu ve sediment örneklerinin ağır metal analizleri Marmara Üniversitesi’ndeki ICP-MS ile yapılmıştır. SS

(Standart Sapma) değerleri %3’ten küçük olan değer elde edilene kadar ölçüm tekrarlanmış ve sonuçlar kıyaslanabilir olması için birim hacimdeki veya birim kütledeki mol olarak verilmiştir. Elde edilen sonuçlar, su ve sediment arası boşluk suyunda molarite (M=mol/L) ve sedimentte molalite (m=mol/kg-ıslak ağırlık) olarak hesaplanmıştır. Hesaplanan sonuçlar grafik olarak “Bölüm 6” da verilmiştir.

3.5.2.2 Bitki Numunelerinin Analizi

Başka araştırmacıların çalışmaları incelenerek, bitkideki ağır metal miktarının tespiti için yapılan parçalamalarda farklı kimyasallar ve farklı oranlar kullanıldığı görülmüştür. Yapılan çalışmalarda bitkiyi ağır metal analizine hazır hale getirmek için değişen oranlarda HNO3 ile H2O2 yada HNO3 ile HCl kullanıldığı rapor edilmiştir (Yang vd., 2006; Almeida vd., 2006; Kamal vd., 2004, Prasad vd., 2001). Bu çalışmada HNO3,H2O2 ve HCl beraber kullanılmıştır. Kullanılan oran HNO3,H2O2 ve HCl için sırasıyla 5/1/1 (v/v/v) dir. Organlarına ayrılan bitki parçaları parçalandıktan sonra, örnekler analize kadar plastik kaplarda, ışık geçirmeyen yerde saklanmıştır. Erns (1982) çalışmasında gram ile belirlenen konsantrasyonların biyolojik olarak uygun olmadığını belirtmiş ve konsantrasyonların mol olarak verilmesini önermiştir (Evirgen, 2003). Bu nedenle bitkilerin farklı organlarını (kök, gövde, yaprak) içeren örnekler ICP-MS’de ölçülüp molalite (m=mol/kg-kuru ağırlık) olarak hesaplanmıştır.

Yaprak dokularında klorofil a ve klorofil b miktarları Lichtenthaler’in (1987) yöntemine göre belirlenmiştir. Yaprak dokularından alınan örnekler tartıldıktan sonra sıvı azotla dondurulup parçalanmıştır. Parçalanan yaprak örnekleri falkon tüplerine konularak, üzerine 5 ml %99 aseton ilave edilmiştir. Dokular tamamen beyazlaşıp pigmentlerini kaybettiğinde elde edilen duru fazdan spektrofotometrede absorbansları okunmuştur. Lichtenthaler’in (1987) yönteminde 661,6 ve 644,8’de ölçüm yapılmıştır. Ancak kullanılan YTÜ Çevre Mühendisliği’ndeki Novespec II spektrofotometre cihazı ondalık değerdeki dalga boylarını (λ) ölçemediğinden, 661,6 nm dalga boyu spektrum üzerindeki 662 nm olarak klorofil a’nın, 644,8 nm dalga boyu ise spektrum üzertindeki 645 nm olarak klorofil b’nin pik yaptığı değer olarak kabul edilmiştir (Şekil 3.12). Klorofil a ve klorofil b miktarları Denklem 3.1 ve 3.2 kullanırak mg.ml–1.g–1 TA (Toplam Ağırlık) olarak hesaplanmıştır.

Şekil 3.12 Klorofil a ve klorofil b’nin absorpsiyon spektrofotometresi

Klorofil a = (11,24 x λ662) + (2,04 x λ645) (3.1)