Norm

Os municípios de Carrancas e de Ingaí estão distantes em linha reta a 30,2 Km e por meio das estradas locais a 62,9 Km. Nestes dois municípios, as populações de

L. pinaster amostradas encontram-se em propriedades particulares. No município de Carrancas

foram amostradas duas populações, uma denominada de Serra Branca (S21º26’44.76” W44º35’16.47”, elevação média de 1116 m) e outra de Serra do Salto (S21º26’44.63” W44º38’15.36”, elevação média de 1285 m), estas populações estão distantes entre si a 5,5 Km em linha reta (Figura 5). No município de Íngaí a população amostrada foi denominada de Serra da Arnica (S21º26’38.89” W44º56’00.10” e elevação média de 1048 m) (Figura 5).

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Figura 5. Localização geográfica das populações naturais de Lychnophora pinaster Mart. amostradas no atual traballho. Populações Serra Branca (1) e Serra do Salto (2), provenientes do município de Carrancas – MG e População Serra da Arnica (3) proveniente do município de Ingaí – MG. Fonte: Google Earth (2012).

Foram amostrados, no total, 75 acessos, 25 por população, os quais foram todos marcados com etiquetas plásticas e sua localização geográfica (altitude, latitude e longitude) registrada através de GPS (Global Positioning System) (e-trex, Garmin®).

A primeira coleta foi realizada durante o verão, entre os dias 12 e 15 de março de 2012. Nas três populações amostradas os acessos encontravam-se no final do estádio reprodutivo, com poucas plantas apresentando flores e/ou aquênios e a maioria apresentava-se com os capítulos secos e sem aquênios, portanto, no final do período de dispersão. Em Serra da Arnica, a área de amostragem encontrava-se em situação de queimada recente e com muitas plântulas no local.

A segunda coleta ocorreu durante o outono, entre os dias 7 e 8 de maio e em todas as populações os acessos encontravam-se em estádio vegetativo. Na terceira coleta, 12 e 13 de setembro (inverno), mais da metade da população de Serra Branca encontrava-se em estádio vegetativo. Outros acessos encontravam-se com o botão floral evidente e alguns com flores. Três acessos desta população (Pop 103, Pop 109 e Pop 110) estavam sem condições para a coleta do material vegetal (mortos) e não foram amostrados. Nas demais populações, os acessos encontravam-se com o botão floral evidente ou com flores.

43 Na quarta e última coleta, 22 e 23 de novembro (primavera) de 2012, os acessos de todas as populações, no geral, encontravam-se com os capítulos apresentando aquênios, porém, somente na população de Serra da Arnica os mesmos encontravam-se em dispersão. Também foi observada a presença de flores nas populações. Nesta estação, não foram coletados novamente os acessos Pop 103 (morto) e Pop 109 (poucas folhas). Os acessos Pop 110 e Pop 119 também não estavam em condições de coleta, nesta estação.

Durante as coletas foi observado o surgimento de rebrotos na região cortada em amostragens anteriores e herbivoria em diversos acessos, principalmente, no inverno e primavera.

5.1.3. Amostragem e Beneficiamento do Material Vegetal

Porções da parte aérea (caule, ramos e folhas) de aproximadamente 150g de cada acesso foram amostradas, armazenadas em sacos plásticos, indvidualmente identificadas e transportadas desta forma até a cidade de Campinas/SP. Coletou-se, também, material botânico fértil de cada população para a confecção das exsicatas (1 exsicata por população, denominadas de SILVA 001, 002 e 003). As mesmas foram depositadas no herbário do Instituto Biológico da Universidade Estadual de Campinas após a identificação pelo Prof. Dr. João Semir, especialista no gênero Lychnophora da Univeridade Estadual de Campinas.

5.2. Análise de Solo dos Locais de Coleta

A caracterização quanto à fertilidade dos solos dos três locais de coleta foi realizada com base na análise química de macro e micronutrientes. Foram coletadas aleatoriamente 10 amostras de solo para cada região de coleta com pá, devido ao solo superficial e pedregoso, que impossibilitou o uso de trado e a coleta do solo a 20 cm de profundidade, que é o procedimento padrão.

44 As amostras foram encaminhadas para o Laboratório de Solos da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Botucatu/SP.

5.3. Extração e Análise da Composição Química dos Óleos Essenciais

Após cada expedição de coleta do material vegetal (porções da parte aérea) as folhas de cada acesso foram manualmente separadas dos caules, ramos e inflorescências e as folhas foram armazenadas em sacos de papel devidamente identificados por acesso até o momento da extração do óleo essencial que foi feita individualmente por meio de hidrodestilação em aparato tipo Clevenger por um período de duas horas. Após a extração dos óleos essenciais de cada acesso das três populações, os mesmos foram armazenados individualmente em frascos de vidro devidamente identificados e, em seguida, calculou-se o rendimento. Posteriormente, os mesmos foram mantidos em freezer a 4ºC até o momento da análise de composição química.

A análise da composição química dos óleos essenciais foi feita individualmente para cada acesso. Para tanto, foram feitas amostras em triplicata compostas de 1µL de óleo essencial do acesso + 1 mL acetado de etila (grau cromatográfico). O volume de

injeção da amostra foi de 1µL de solução e a análise foi conduzida em cromatógrafo a gás

acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM; Shimadzu, QP-5000) operando a 70 eV, dotado de coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm), hélio como gás de arraste (1 mL/min), injetor a 2400C, detector a 2300C, modo de injeção split e o seguinte programa de temperatura: 60ºC (5 minutos) – 180ºC, 3ºC/minuto; 180ºC - 240ºC, 10ºC/minuto; split 1/20.

A identificação dos constituintes químicos foi efetuada por meio da análise comparativa dos espectros de massas das substâncias com o banco de dados do sistema CG-EM (Nist 62.lib) e literatura, índice de retenção (IR) (ADAMS, 2007). Os índices de retenção das substâncias foram obtidos a partir da injeção de uma série de n-alcanos (C9-C40),

45 A quantificação das substâncias foi efetuada por cromatografia a gás com detector de ionização de chama (CG-DIC; Shimadzu 2010) operando nas mesmas condições que o sistema CG-EM.

5.4. Análises Estatísticas

Os resultados de rendimento e da composição química dos óleos essenciais foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tukey (P<0,05) com auxílio dos programas estatísticos GENES vs. 2009. 7.0 e ASSISTAT 7.6 beta. A análise multivariada foi feita utilizando-se a Análise de Componentes Principais (ACP) e as análises de agrupamento foram realizadas a partir da avaliação fenotípica, onde se agrupou os acessos de acordo com a sua composição química, levando em conta as quatro substâncias com maiores proporções relativas médias identificadas no óleo essencial pela análise de Cluster Aglomerativa Hierárquica (CAH), empregando-se o programa XLSTAT (2012).

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