Nonkompetitif ölçümler (sandviç yöntemi):

Polisteren ölçüm tüplerinin iç duvarına veya boncuklara, antijen için spesifik antikorlar fazla miktarda adsorbe edilir. Ölçüm tüpüne eklenen örnekteki tüm antijenlerin immobilize antikorlara bağlanması için inkübasyon yapılır. Yıkama yapıldıktan sonra, ölçüm tüpüne enzim (alkalen fosfataz) işaretli ikinci antikor eklenir. İkinci inkübasyon süresince primer antikor-antijen-enzim (alkalen fosfataz) işaretli ikinci antikor kompleksi oluşur. Eğer ikinci antikor monoklonal ise, antikor substrat ile eşzamanlı eklenebilir ve yalnız bir kez yıkama yapılır; değilse ikinci yıkamadan sonra ölçüm tüpüne substrat (p-nitrofenilfosfat) eklenir. Standartların, kontrollerin ve örneklerin absorbansı, durdurucu reaktif (1N H2SO4) eklendikten

20

sonra 2 saat içinde uygun dalga boyunda spektrofotometre kullanılarak belirlenir. Konsantrasyonlar, standart eğri yardımıyla bulunur.

2.4.2. CMİA

Antijen , antikor ve analitlerin örnekler içerisinde belirlenmesini sağlayan bu yöntem kimyasal mikropartikül luminans imunoessay olarak adlandırılır. Bu yöntem için gerekli kimyasallar şunlardır:

• Aranan analit için manyetik olarak işaretlenmiş antijen, antikor veya virütik tanıyıcı kaplı mikropartiküller

• Akrinidyum işaretli konjugat • Ön başlatıcı solüsyonlar

Şekil 2.6 CMIA gösterimleri

1)Tanıyıcı ajan ile kaplı Anti-Analit Mikropartikül 2) Hedef Molekül 3) Akrinidyum işaretli konjugat 4) Ölçülmek istenilmeyen örnek

CMİA (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) sisteminde sıralama hedef moleküle göre değişmektedir ve her bir assay için protokoller farklılık göstermektedir. En basit haliyle protokolün temel mantığı şu şekilde özetlenebilir:

21

• Otomatik pipet mikropartikülleri (manyetik işaretli tanıyıcı ile kaplanmış) örneğin bulunduğu reaksiyon küvetine bırakır. Vortex ile karışmaları sağlanır.

Şekil 2.7 Hedef ile Mikropartiküllerin Etkileşimi

• Reaksiyonun gerçekleştiği çözelti içerisinde hedef molekül mikropartiküller ile bağlanarak immun kompleks oluşturur.

• Mıknatıs yardımı ile manyetik işaretli mikropartiküllerin (hedef ile bağlanmış) reaksiyon küvetinin duvarına çekilmesi sağlanır. Yıkama solüsyonu ile bağlanmayan moleküllerin ve atıkların reaksiyon küvetinden atılması sağlanır.

22

• Otomatik pipet, kimyasal luminans akrinidyum işaretli konjugatı reaksiyon küvetine boşaltır. Konjugat immun komplekse bağlanır ve reaksiyon karışımı tamamlanmış olur.

Şekil 2.9 Akrinidyum işaretli konjugatın mikropartikül ile bağlanması • Bağlanmayan moleküller yıkama küvetinden atılır.

• Ön-Reaksiyonu başlatıcı solüsyon (hidrojen peroksit) havuza aktarılır ve sistem ilk optik okumasını alır. Bu solüsyonun temel görevi ortamı asidik hale getirmek, erken enerji boşalımını (ışık yayılımı) engellemektir. Bunun yanında mikropartiküllerin topaklanmasını engeller ve akrinidyum boyanın mikropartikül kompleksinden ayrılmasını sağlar ve boya bir sonraki adım için hazır hale gelir.

• Reaksiyon başlatıcı solüsyon (Sodyum Hidroksit) eklenir. Akrinidyum, peroksit ve alkali bir solüsyona maruz kalarak oksidatif bir reaksiyona girer.

• Bu reaksiyon kimyasal luminans reaksiyonun gerçekleşmesini sağlar. N- Methilakridon oluşur ve normal formuna dönerken enerji (ışık) yayılmasını sağlar.

• CMIA optik sistem kimyasal ışık yayılımını belli bir zaman süresince okuyarak analit için kuantatif ölçüm gerçekleştirir veya kantitatif ölçüm için eşik değer tespiti yapar.

23 2.4.3. Yüzey Plazmon Rezonans

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) bölgesel kırılma indisindeki değişimleri algılayarak metal yüzeylerindeki moleküler bağlanmaları ölçen optik biyosensör tekniğidir. SPR; çözelti-faz ve immobilize biyomoleküller arasındaki etkileşim olan çalışmalarda kullanılan yüzey duyarlı bir tekniktir. SPR, floresan ve ELİSA gibi tekniklere göre birçok avantaj sağlamaktadır. Ölçümlerin kırılma indislerinin değişmesi, analitlerin saçılma bandı, etiketi gibi özelleşmiş karakteristiklerine gerek duyulmaması ,direk algılanması, geniş moleküler ağırlık ve bağlanma etkinliği aralığında analitleri algılaması SPR’nin avantajlarındandır. Aynı zamanda SPR geniş kullanım alanına sahiptir. Örneğin; protein–peptid etkileşiminin gözlenmesi, protein-DNA etkileşiminin gözlenmesi, DNA hibridizasyonu gibi çalışmalarda kullanılmaktadır.(Dutra and Kubota, [11])

Genellikle gümüş ve altın metal ara yüzeylerinin uyarılmasıyla elektromanyetik dalgalar oluşur. Metal yüzeyine gelen açı kritik açıdan daha büyük olduğunda yansıyan ışıkta azalma gözlenir. Bu azalmanın sebebi gönderilen ışıktan plazmon yüzeye olan enerjinin rezonans transferinin yansıyan ışıkta keskin bir azalmaya sebep olmasıdır. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı ya da SPR açısı adı verilir. Bu geliş açısında ışık, yüzey plazmonlarını (elektron paketçikleri) harekete geçirecek, yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşecektir. Yüzey plazmon rezonansı iki optik ortamın ara yüzeyine ince iletken bir film yerleştirildiğinde meydana gelir. Spesifik bir geliş açısında metal yüzeyindeki elektron frekanslarının eşleşmeleri nedeniyle gelen ışık ile rezonans durumuna gelecektir. Bu rezonans durumunda enerji absorblanacağı için yansıyan ışının yoğunluğunda bir azalma meydana gelmektedir. Yansıyan ışıkta gerçekleşen bu durum yüzeyde kaplamanın gerçekleştiğinin göstergesidir.(Bergstrom and Mandenius, [3]; Green et al., [15])

SPR sensörü çapraz bağlanmış dextran içeren altın kaplı cam diskten oluşmaktadır. Yüzey karakterizasyon etkisinden dolayı dextran matriksi bağlanma kapasitesini arttırmaktadır. Antikor ile streptavidin konjuge çiftlerdir ve streptavidin dextranın birincil amin grubuna bağlanabilir yapıdadır. Bu yapılar sayesinde bağlanma gerçekleştiğinde yansıyan açıda oluşan değişim gözlemlenir. Değişen

24

açı ile bağlanan malzeme miktarı arasında doğrusal bir ilişki bulunmaktadır. SPR açısındaki miliderece değişiklik sensör yüzeyindeki makromoleküllerin bağlanma kalitesinin cevabı olarak kullanılmaktadır. 120 miliderece değişim yüzeydeki proteinlerin yaklaşık 1 ng/mm2 değişimini yada yığın kırılma indisinin yaklaşık 10− 3 değişimini ifade etmektedir. Bu değerler ile SPR tekniği ile metal yüzeylerine bağlanan moleküllerin gözlemlenmesi gerçekleşmektedir.(Bergstrom and Mandenius, [3])

Şekil 2.10 Yüzey Plazmon Rezonans Çalışma Prensibi 2.4.4. İmmunokromatografik

Son yıllarda kardiyak belirteçlerden troponin için kullanılan kalitatif; ancak çok hızlı sonuç veren yeni testler geliştirilmiştir. Bu testlerin temel mantığı kromatografik yönteme dayanmaktadır. Test kartuşu kromatografik bir membran üzerinde iki farklı bölgeye immobilize edilmiş antikorlar ile bir filtre üzerine uygulanmış renkli partiküller içeren çözülebilir taşınabilir ajan içeren malzemeden oluşur. Test, örnek havuzuna yaklaşık 100µl serum damlatılması ile gerçekleştirilebilmektedir. Damlatılan serum örneği renkli işaretçiler içeren filtre boyunca akar, örnek ve işaretçiler daha sonra birlikte membrana geçerler ve burada diğer belirteç bölgeleri ile temas ederler. Örnek içerisindeki troponinler antikorleri tarafından immobilize edilirler ve membran üzerindeki o bölgede renk değişimi sonucu bir çizgi oluşur. Geri kalan partiküller ise ikinci antikor bölgesinde immobilize olurlar ve kontrol

25

çizgisini oluştururlar. Bazı durumlarda ek donanım ile çizgilerin yoğunluğu izlenerek troponin yoğunluğu belirlenebilir. (Cloney et al., [9])

Şekil 2.11 İmmunokromatografik Ölçüm Gösterimi 2.4.5. Elektrokimyasal

Biyosensör geliştirme konusunda genelde en büyük ilgiyi çeken elektrokimyasal cihazlardır. Bu cihazlar hasta izlenmesi için basit, maliyeti düşük, kesin ve hassas sonuçlar üretmektedir. Elektrokimyasal biyosensörlerin molekül izleme çalışmalarına uygulanması biyolojik tanıyıcı molekül ile elektrot dönüştürücü çifti ile ilgilidir. Çeviricinin amacı biyolojik olarak tanınabilecek bir olayı, kullanılabilir bir elektrik sinyaline çevirmektir. Amperometrik ve potansiyometrik çeviriciler elektrokimyasal biyosensörlerde en çok kullanılan bağlantılardır. Potansiyometrik cihazlarda analitik bilgi, biyolojik olarak tanıma işleminin biyopotansiyele iyon seçicili elektrotlar sayesinde çevrilmesiyle gerçekleşir. Amperometrik biyosensörlerde; sabit bir voltaj uygulanır ve elektroaktif içeriğin indirgenme ve yükseltgenme işlemlerinin sonucunda oluşan akım değişimi gözlenir. Amperometrik biyosensörler yüksek duyarlılığı ve geniş doğrusal ölçüm aralığı ile daha uygundur. Yeni geliştirilen biyosensörlerde, sayısız teknolojik inovasyonun bir araya getirilmesi amperometrik sensörlerin geniş klinik uygulamalarda kullanılmasının önünü açmıştır. Yüksek duyarlılığı, seçiciliği, kullanım kolaylığı ve küçük olması bu elektriksel biyoanaliz sistemlerinin karışık optik protokollerle

26

yarışabilmesini sağlamaktadır. Minyatürleşme biyoçip cihazındaki küçük bir parmak izi içine sayısız mikroskobik elektrot dönüştürücü yerleştirilebilmesine olanak vermektedir ve sonucunda yüksek yoğunlukta diziler elde edilebilmektedir.(Ko et al., [19])

Yapılan bir çalışmada; hassas, güvenilir ve taşınabilir elektrokimyasal immünosensör; birbirinden ayrı ölçüm havuzcukları, mikroelektrot çip ve elektrokimyasal olarak cTnI konsantrasyonu ölçen PDMS kanal kullanılarak geliştirilmiştir. Silanizasyon işlemi PDMS kanallarının iç yüzeyinde gerçekleştirilmiş olup, yüzey altın elektrotlar dışında karboksil gruplarına maruz bırakılmıştır. Protein G , IgG antikorunun Fc kısmına spesifik olarak bağlanabilen bir proteindir. Protein G, silan film üzerine anti-cTnI’dan sonra immobilize edilmiştir ve bu immobilizasyon anti-cTnI’nın oryantasyonunun düzenini arttırmıştır. Aynı zamanda parazit olmadan antikorun antijene bağlanması sırasında oluşabilecek üçüncül yapıların Fab kollarındaki serbest hareketlerini arttırdığı belirtilmiştir. (Boyle and Reis, [5])

Elektrokimyasal mikroçip tabanlı biyosensör insan kardiyak troponin I (cTnI) görüntülenmesi için geliştirilmiştir. Kardiyak Troponin I, miyokard enfarktüsünde oluşan miyokardiyal hasarın erken dönemde görüntülenmesini sağlamaktadır. Mikroçipin düşük görüntüleme limiti olup, 148 pg/mldir. Bu değer, analit enjekte edildikten 8 dakika sonra son elektrokimyasal sinyalden önceki görünen değerdir. Elektrokimyasal sinyal; protein G tarafından antikordaki düzenli oryantasyona, sterik engelleri azaltan en iyi paketleme yoğunluğuna ve yüzeyi karakterize edilmiş, kirlenmemiş altın elektrota dayandırılmaktadır. Bu sonuçlar biyosensörün hassasiyetini arttırmıştır. Üstelik bu sistem geleneksel yöntemlerden çok daha ekonomik , hızlı ve basit olup bakım noktası analizine izin vermektedir. (Ko et al.) 2.4.6. Kuvars Kristal Mikroterazi Biyosensörler