Namık Kemal ve Eskinin Karşısında Cedid Bir Edebiyatın İnşâsı

Os ensaios de EMSA, também conhecido como ensaio de mobilidade em gel, foram realizados com a proteína recombinante His-3043 e com extrato proteico total de N. crassa.

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46 Nesses ensaios, fragmentos de DNA marcados (sondas) dos promotores gsn e gpn foram testados quanto à capacidade de ligação das proteínas.

14.1. Preparo do extrato bruto protéico

Uma suspensão de conídios da linhagem selvagem de N. crassa (aproximadamente 109

células/mL) foi inoculada em 2 L de meio VM líquido e colocada a 30ºC sob agitação constante de 250 rpm por 24 h. Após esse período, o micélio foi coletado por filtração a vácuo em papel filtro, rapidamente congelado em nitrogênio liquido e armazenado a -80ºC.

Cerca de 10 g do micélio foi pulverizado em nitrogênio líquido. Em seguida, o pó foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL contendo 10 mL de tampão de lise (15 mM HEPES pH 7,9; 500 mM KCl; 0,5 mM EDTA pH 8,0; 5 mM MgCl2_{; 25 mM benzamidina, 1 mM DTT; 0,5}

mM PMSF; 50 mM NaF; 10 μg/μL de antipaína e pepstatina A; 10% (v/v) glicerol) e homogeneizado com glass beads em vortex (8 pulsos de 30 seg x 30 seg no gelo). A solução protéica foi separada das beads por centrifugação (4.000 rpm/4°C/2 min), transferida para tubos eppendorfs limpos de 2 mL e centrifugada a 14.000 rpm/4°C/15 min. O sobrenadante foi dializado contra tampão D (15 mM HEPES pH 7.9, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, glicerol 15%) por 2h e submetido à purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Heparina-Sepharose (5 mL) (GE Healthcare) em aparelho de purificação Akta Prime (Amersham). A estrutura da heparina no método utilizado serve como análogo ao DNA permitindo a ligação de proteínas ligadoras de DNA. As proteínas foram eluídas em um gradiente linear de 0,1 a 1,5 M de KCl preparado em tampão D de coluna gelado. As frações coletadas foram dializadas duas vezes contra tampão D, e reservadas para serem testadas quanto à capacidade de ligação com sonda de DNA específica.

14.2. Preparo e marcação das sondas de DNA

Sondas radiativas correspondentes aos fragmentos de DNA a serem analisadas quanto à capacidade de ligação das proteínas foram obtidas por PCR, utilizando primers (tabela 4). As reações de amplificação foram realizadas utilizando 1,0 μg DNA, 0,5 μL de enzima Taq Polimerase (Invitrogen), 1 μL dos oligonucleotídeos F e R (100 pmol/μL), 5 μL de tampão de PCR 10x, 2,5 μL de MgCl2 50 mM, 1 μL de dNTP (10 mM) e 2 μL de α-[32P]dATP (104 cpm). Os

ciclos da PCR foram: desnaturação (96ºC/1 min), anelamento (50-52ºC/1 min) e extensão (72ºC/1 min), por 39 ciclos, num volume final de 50 L de reação. Os fragmentos de DNA amplificados foram purificados em low melting point agarose 2% em TAE 1X, precipitados com glicogênio 20%, acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e etanol absoluto e usados como sondas nos ensaios de EMSA. A capacidade de ligação da proteína recombinante purificada His-3043 foi testada em relação à duas seqüências da região promotora do gene gpn contendo o elemento

47 cis correspondente ao sítio de ligação da proteína homóloga FlbC. Os fragmentos de DNA contendo as seqüências desejadas usados como sonda referente ao promotor gpn foram amplificados por reações de PCR contendo 1 μL (100 pmol/μL) dos pares de oligonucleotídeos FlbC-F /FlbC-R.

Tabela 4 – Oligonucleotídeos utilizados nos ensaios no preparo de sondas para EMSA. Oligonucleotídeos

SREBP-FP2: 5´-CATgggAgTATTCgTTgC - 3´ SREBP-RP2: 5´-TCTgACCTTTCCCAATCAg - 3´ FlbC-F: 5´-gggAgACggCAAAggCgAT - 3´

FlbC-R: 5´-gAAggACATAgAgATAgg - 3´

Neste processo, um primeiro fragmento de DNA foi amplificado a partir de 400 ng de DNA genômico da linhagem selvagem utilizando a enzima Taq Polimerase (Invitrogen) em um volume final de 50 L de reação. Esse fragmento foi excisado do gel de agarose 1%, purificado através do kit GeneClean (BioMP) e clonado no vetor pMOSBlue (pMOS-gpn). Para o preparo das sondas de DNA, uma nova reação de PCR contendo 3 μL de α-[32_{P]dATP (10}4 _{cpm) foi}

realizada, conforme descrito anteriormente, a partir da construção pMOS- gpn. O produto da amplificação foi digerido com as enzimas SacI e HindIII para a liberação de seqüências de DNA com 241 pb e 313 pb, os quais foram utilizados nas reações de ligação.

Para o preparo da sonda Sre1, um fragmento de DNA do promotor gsn contendo o elemento cis correspondente ao sítio de ligação da proteína codificada pela ORF NCU04731 foi amplificado por PCR com os oligonucleotídeos SREBP-FP2 e SREBP-RP2. A reação de PCR foi realizada conforme descrito anteriormente e o fragmento de DNA resultante da amplificação gerou uma sonda de 164 pb.

14.3. Competidores específico e inespecífico para os ensaios

Em todas as reações de ligação contendo a proteína e a sonda marcada para análise da interação DNA-proteína foram utilizados o copolímero poli(dI-dC)x(dI-dC) (GE Healthcare) como competidor inespecífico. Em uma segunda etapa do processo, competidores específicos foram preparados como as sondas utilizadas, sem sofrerem marcação radiativa e foram utilizados para a confirmação da especificidade da interação DNA-proteína apresentada. A reação de PCR foi mantida nas mesmas condições descritas com os mesmos oligonucleotídeos, e os fragmentos de DNA foram purificados em low melting point agarose 2% em TAE 1X.

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14.4. Ensaio de mobilidade em gel

A interação DNA-proteína foi realizada em 30-100 L de um tampão de ligação 1X (125 mM HEPES pH 7,9, 100 mM KCl, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 50% glicerol v/v) contendo uma mistura de inibidores de protease (0,05 mM DTT, 0,025 mM PMSF, 5 μg/mL benzamidina, 5 μg/mL antipaína A, 5μg/mL pepstatina, 5 μg/mL NaF), 2 g/reação de poli(dI-dC)x(dI-dC) e 2,0 a 20 g da proteína recombinante His-3043 purificada ou 20-60 g do extrato total (no caso da sonda Sre1). Na primeira etapa da reação, diferentes concentrações de proteína (purificada ou do extrato celular total) foram incubadas em tampão de ligação à temperatura ambiente adicionadas de 0,6 ng de sonda marcada (104 _{cpm) durante 20 min. Para o ensaio de}

competição, o competidor específico foi adicionado à reação de ligação 10 minutos antes da adição da sonda marcada. O competidor específico foi adicionado em um excesso molar de 10 a 20X superior à concentração de sonda. Após incubação com a sonda, as reações foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 4-5% (29:1) não desnaturante, em tampão TBE 0,5X (300 V, 10 mA, 15ºC). O gel foi secado e autoradiografado em filme Kodak T-Mat G/RA.