Nükleik Asidi Temel Alan Teşhis Metotları

Nükleik asit esaslı teknikler yaygın olarak bitki virüslerinin özellikle polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) ortaya çıkmasından sonra tespit ve teşhisinde kullanılmaya başlanmıştır (Saiki vd., 1988). Serolojik teknikler yaygın olarak kullanılsa da virüs tespiti için nükleik asit yöntemleri ile karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır. Bu serolojik testlerin dezavantajı kılıf protein temelli tekniklere dayanmasıdır. Viral proteinlere dayalı yöntemler virüsün sadece % 10'unu temsil eden antijenin özelliklerini temsil eder ve virüs genomunun (Gould ve Symons, 1983) geri kalanını ihmal eder. Nükleik asit temelli saptama yöntemlerinde virüs genomundaki herhangi bir bölge hedeflenip teşhis yapılabilir. Dahası bazı durumlarda serolojik yöntemler özellikle viroidlerin, uydu RNA'ların, parçacıklardan yoksun olan virüslerin (örneğin Groundnut rozet virüsü (GRV), son derece farklı serotipler halinde ortaya virüslerin (ör. Hint ve Afrika Yerfıstığı kümesi virüsü ve Tütün çıngıraklı virüsü) teşhisinde kullanılamamaktadır (Naidu ve Hughes, 2003).

Bitkiler çok çeşitlidir ve bireysel türler, organlar veya bitkilerdeki dokular moleküler olarak kullanılmak üzere RNA (ve DNA) ekstraksiyon çalışmaları sırasında farklı davranırlar. Buna bağlı olarak, çeşitli ekstraksiyon yöntemleri de geliştirilmiştir. Karşılaşılan sorunlar şunlardır: büyük miktarlarda polisakaritlerin varlığı; yüksek RNaz seviyeleri; çeşitli tanenler de dâhil olmak üzere farklı fenolikler; düşük yoğunluklu nükleik asitler (yüksek su içeriği); Lignin (ahşap) gibi dokular için zor ayrışmasıdır. Genellikle, biyoteknolojik ürün pazarlayan şirketlerden satın alınan kitler nükleik asit izolasyonu için yeterlidir, ancak bazen, daha önce RNA izole edilmemiş yeni bir bitki veya doku kullanılacağında, bu malzemenin özelliklerine uyması için yöntemlerin değiştirilmesi gerekebilir. Bir dokudan RNA izolasyonunun zor olacağına dair basit bir işaret yoktur. Çıkarılan RNA'nın kullanımına bağlı olarak, haberci RNA'nın (mRNA) daha fazla saflaştırılması gerekebilir. Genel olarak, ticari kitler bu işi yeterince yapabilmektedir. RNA ekstraksiyonunda karşılaşılan en büyük problemler, genellikle ilk örnekleme ve ekstraksiyon yöntemleri, uygulamayı yapan kişinin tecrübesi ve ekstraksiyonu dikkatle yapma derecesidir.

PCR çalışmalarında başarıyı etkileyen faktörlerden birisi de nükleik asit ekstraksiyonunda kullanılan yöntem ve ekstraksiyon sonucunda elde edilen viral

RNA’nın kalitesidir (Boston ve Haliloğlu, 2010). PCR çalışmalarında başarı elde edebilmek için direkt ham bitki öz suyu yerine saflaştırılmış RNA’nın kullanılması daha etkili olup, özellikle dejenere pirimerlerin toplam nükleik asit materyallerinde rastgele bir bölgeye bağlanma olasılığını ortadan kaldırmak için saflaştırılmış RNA kullanılması gerekmektedir (Langeveld vd., 1991). Depoda +4ºC’de muhafaza edilmiş “Shebody” çeşidine ait dormant yumrularda, PVY0 ırkının, (Spiegel ve Martin, 1993)’e göre ekstrakte edilmiş toplam RNA’ların RT-PCR tekniği ile analiz edildiğinde virüs belirlenemezken; toplam RNA Lopez-Moya vd., (1992) yöntemine göre elde edildiğinde başarılı sonuç alınmış, bu nedenle RNA izolasyon yönteminin teşhisde önemli rol oynadığını belirtilmiştir (Singh vd., 1996).

IC yöntemi; bitki virüsü ile antijen eşleşmesine dayalı bir teşhis metodudur. Genini çoğaltmak istediğimiz virüse ait, spesifik antiserumunun steril katı yüzeye sabitlenmesiyle gerçekleşen virüs teşhis metodudur. Bu aşamadan sonra RT-PCR basamakları uygulanır ve hedef gen bölgesi çoğaltılır. Bu yöntemin avantajı bitki dokusuna ekstraksiyon yöntemi uygulanmadan yapılan hızlı, masrafsız olmasıdır.

2.4.1 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

PCR son derece spesifik, hassas ve uyarlanabilir olup, çok az miktardaki hedef nukleik asidin çoğaltılmasında büyük bir potansiyele sahip çok yönlü in vitro yöntemdir. Bölgeye spesifik primerler kullanılarak çok az miktarda hedeflenen nükleik asid termostabil DNA polimeraz enzimi ile çoğaltılmaktadır (Gould ve Symons, 1983; López vd., 2003). Üç aşamalı döngü kullanılmaktadır. denatürasyon, primer eşleşmesi, primer uzamasıdır (Şekil 2.4).

Denatürasyon aşamasında, DNA yumağı, hift sarmal ve iki eş zincir artan sıcaklık sayesinde birbirinden ayrılmakta, tüm enzimatik reaksiyonlar durmaktadır. DNA denatürasyonu sağlamak için thermocycler sıcaklığı yaklaşık 93-96°C’ye çıkarılır. Yüksek sıcaklık etkisi ile kuvvetli hidrojen bağları kırılır, ortamdaki çift sarmal (ds) DNA, tek sarmal (ss) DNA formuna dönüşür. Mevcut dsDNA’nın yarısının tek kol haline dönüştüğü sıcaklık (Tm), erime sıcaklığıdır ve DNA hibridizasyonunda ve primer bağlanmasında önemli bir kriterdir. Düşük tuz konsantrasyonu, yüksek pH ve formaldehit gibi organik çözücülerin bulunması durumunda Tm düşer. DNA’nın içerdiği nükleotid

çiftlerinin oranı yani G/C ve T/A miktarları da Tm’i etkiler. G/C miktarı yüksek olan DNA’nın Tm’i, T/A miktarı yüksek olan DNA’ya göre daha yüksektir.

DNA zincirlerinin eşleşmesi veya yeniden bağlanması daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşmektedir (genellikle 55-65°C). Sıcaklık düşünce, birbirine eş iki ssDNA zinciri arasında yeniden hidrojen bağları oluşarak dsDNA oluşturur. Tek zincir primerler ile tek zincir hedef DNA arasında hidrojen bağlar oluşur (annealing). Hedef DNA’ya tam olarak eşleşen primer ile ana zincir arasındaki bağlar daha sağlam ve uzun süreli olur. Meydana gelen bu küçük dsDNA parçası (primer-template) üzerine DNA polimeraz bağlanarak ana zinciri kopyalamaya başlar. Birkaç baz eklendikten sonra primer ve template arasındaki iyonik bağ kuvvetlenir ve kırılmaz.

Sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz (genellikle Taq DNA Polimeraz) ile dNTP’lerin varlığında primerler hedef zincir boyunca uzatılır. Bu reaksiyon başlangıçtaki hedef DNA materyalinin iki katına çıkar (birebir kopyalama). Taq Polimerazın en uygun çalışma sıcaklığı 72°C’dir.

Primerlerin bir kaç baz uzamasından sonra, hedef alınan DNA’ya karşı daha yüksek iyonik çekime sahip olurlar. Bu durum yapılan işlemin geri dönüşünü engellemektedir. Tam olarak eşleşmeyen (uyuşmayan) primerler yüksek sıcaklıktan dolayı gevşer ve böylelikle reaksiyon DNA parçası uzamaz. Ana DNA’ya eş olan bazlar primere 3’ üstünden bağlanır. Polimeraz ana zinciri 3’-5’ üstü yönünden okunurken, 5’-3’ üstünden de dNTP ekler. Primer uzama basamağı çoğaltılacak DNA’nın uzunluğuna göre arttırılabilir. Ama genellikle PCR testlerinde 1 dakikalık uzama zamanı tam sentez için yeterli olmaktadır.

2.4.2 Real-Time PCR sistemleri

Real time-PCR yöntemi DNA’nın çoğaltımını ve eş zamanlı olarak ürünlerini tek bir tüpte belirlemeyi mümkün kılan bir metottur. Çoğaltılan DNA’nın teşhisi PCR reaksiyonu sonrasında değil de sırasında yapıldığından analiz süresi kısalmakta, ethidium bromide gibi tehlikeli kimyasallar kullanılmamakta ve işlemden sonra tüplerin ağzı açılmadığından örneklerin karışma riski olmamaktadır. PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir çoğaltma yöntemidir.

Real-time PCR yöntemi çeşitli amaçlarla nükleik asitlerin kalitatif veya kantitatif olarak saptanabilmesi amacıyla kullanılabilmektedir. Real-time PCR yöntemini, daha önceden geliştirilmiş olan standart PCR yönteminden ayıran iki önemli özellik vardır: Birincisi, real-time-PCR yönteminde termal döngü cihazıyla birleştirilmiş bir optik okuma sisteminin kullanılmasıdır. İkincisi ise, PCR işlemi sırasında amplifikasyonu bilgisayar ekranına yansıtacak bir probun veya probların bulunması gereğidir. Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, real-time PCR işleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Probun işlevi, cihaz içerisinde gerçekleştirilmiş olan çoğaltma işleminin, gözle görülür hale getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin, dNTP’lerin ve enzimin kullanımıyla PCR işlemi gerçekleşecektir. Ancak prob kullanılmadan sonucun real-time PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi mümkün olmayacaktır.

Uygun teşhis sisteminin seçimi real time-PCR çalışmalarında en önemli noktalarından biridir. Spesifik olmayan çift zincirli DNA’ların çoğaltımında “SYBR Green I” yöntemi

kullanılmaktadır. SYBR Green I yönteminde kullanılmakta olan floresan boya sadece çift zincirli DNA’ya bağlandığından çoğalan DNA miktarındaki artışa bağlı olarak “real-time” PCR cihazında okunan floresanın miktarı da eş zamanlı olarak artmaktadır. Bu yöntem en fazla kullanılan boya çeşitidir ve 497 nm dalga boyunda yükseltgenir ve 520 nm dalga boyunda indirgenir. Çift sarmal DNA’nın küçük oluğuna bağlanan boya, 30 amplifikasyon döngüsü sonrası aktivitesinin % 6’sını kaybetmektedir (Şekil 2.5).

Çoğaltımın başında reaksiyon da çift zincirli DNA molekülü, primerler ve “SYBR Green I” boyası yer almaktadır. Bağlı olmayan serbest DNA molekülü çok az miktarda floresan ışıma yapmaktadır. Primerler bağlanıp uzama başladığından itibaren boya molekülü çift zincirli DNA’nın arasına girer ve floresan yayılımı başlar. Başlangıçtaki döngülerde sinyal zayıftır; ürün miktarı artmaya başladığından itibaren floresan miktarı hızlı bir şekilde artar ve bu artış “real-time” cihazının monitöründen izlenebilmektedir. Bu yöntem en uygun PCR şartlarında ve dizaynı iyi yapılmış primerler ile beraber çok fazla sayı da hedef genin çoğaltılmasına imkân vermektedir.

Şekil 2.5. Asimetrik siyanin boya SYBR Green I’in kimyasal yapısı (Günel, 2007)

Floresan boya ile işaretlenmiş problara ihtiyaç duymadığı için maliyeti çok ucuzdur. Bununla birlikte bu yöntemin dezavantajları da vardır. İstenmeyen PCR ürünlerin çoğalması olabilmektedir ve floresan açığa çıkacağından her zaman hedef aldığımız DNA’nın çoğaldığını işaret etmez. Bu durumda yanlış pozitif sonuç alınabilmektedir. Ortamda spesifik DNA dizisi olmadığında primerlerin birbiri ile bağlanmaları sonucunda “primer dimer”leri olarak adlandırılan ve çift zincirli DNA bölgelerinin çoğalımı ile floresan ışıma gözlenebilmektedir. Çoğaltılan DNA’nın istenilen hedef bölge olup olmadığını bilebilmemiz için DNA’ların erime eğrisi analizleri (“melting curve”,

“dissociation”) yapılması gerekmektedir. Erime eğrisi analizi için cihaz PCR tüplerini yavaş bir şekilde ısıtmaya başlar. Çift zincirli DNA birbirinden ayrılmaya başladığında floresan boya serbest kalır ve böylelikle okunan floresan miktarı da düşer. Spesifik olmayan ürünlerin çoğalmasında (primer dimer’lerinde) hedef aldığımız DNA parçasının Tm derecesi arasında farklılık gözlemlenecektir. Genellikle bu yöntemle bilinmeyen iki DNA dizisi karşılaştırılmak istendiğinde yöntem güvenilir bir şekilde kullanılabilmektedir (Şekil 2.6).

Real Time PCR yönteminin başka bir çeşidi olan Taq Man yöntemi vardır. Taq Man yöntemi çoğaltılmak istenen DNA’ya komplementer olan ve floresan boya ile işaretlenmiş tek tek kollu bir prob içerir. Probun 5' ucunda “fluorophore” (6-karboksifloresin= 6-FAM) ve 3’ ucunda “quencher” (6-karboksitetrametil-rodamin= TAMRA) bulunur.

Şekil 2.6. SYBR Green I yöntemi (Günel, 2007)

3’ ucundaki TAMRA boyası 5' ucundaki FAM boyasının sinyal oluşturmasına engel olur. Probun hedeflenen DNA’ya bağlanma oluşturması durumunda bile floresan ölçümü çok

azdır. Çoğalma sırasında hedeflenen spesifik bölge üzerinde primerlerin bağlanma bölgeleri arasına problar bağlanır. Primerlerin bağlanmasından sonra yeni zincir çoğalmaya başlar. Probun bağlı olduğu bölgeye gelindiğinde Taq DNA polimeraz enzimi nükleaz aktivitesi ile FAM’ı probdan keser. Serbest hale gelen FAM sinyal verir. DNA zinciri sentez uzamasına devam eder (Günel, 2007) (Şekil 2.7).

Virüs teşhisinde fazla sayıda örnekle çalışan laboratuvarlarda bitki virüs hastalıklarının hızlı ve güvenilir tanısı çok büyük önem taşımaktadır. Real-time PCR yöntemi, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresan sinyalinin ölçülmesiyle özgüllüğü son derece yüksek olan bir PCR yöntemidir. Çok sayıda örneği, düşük konsantrasyonda bile çok kısa sürede doğru güvenilir sonuç alınabilmektedir. Real time PCR yöntemi; virüs varlığı ve miktarını belirlenmesi, patajon saptanması, DNA hasar tespiti, kromozomlardaki sayısal- yapısal bozuklukların analizinde, RNA çalışmalarında, protein belirleme çalışmalarında kullanılmaktadır.

Şekil 2.7. Taq Man prob yöntemi (Günel, 2007) 2.4.3 Kantitatif real-time PCR

PCR sırasında üç ayrı faz görülür. Birinci faz birkaç döngü süren ve saptanabilir oranda ürünün ortaya çıkmadığı arka plan fazıdır. İkinci faz üslü çoğalma (log) fazıdır. Ürün miktarının saptanabilir en alt düzeye gelmesiyle başlar. Bu fazda ürünler üslü şekilde çoğalırlar. Üçüncü faz ise plato fazıdır. Bunun nedeni reaksiyon ortamında enzim, primer

ve nükleotitlerin tükenmesi, ürünlerin birbiriyle eşleşerek yapışması, yüksek sıcaklıklar nedeniyle hidroliz ve egzonükleaz aktivitesi nedeniyle bir kısım ürünün kaybedilmesidir. Konvansiyonel PCR ile kantitasyonda plato fazında elde edilen ürün miktarı standartlarla karşılaştırılarak ilk baştaki kopya sayısı tahmin edilmeye çalışılır (“end-point” kantitasyon).

Kantitatif Real Time PCR yöntemi ile virüs konsantrasyonunu ölçme ihtiyacı duyabiliriz. Bu durumlar; virüs miktarının bitkide fazla olmazı zarar derecesi ile doğru orantılıdır, bu nedenle, virüs konsantrasyon miktarı ile bitkide ne kadar zarar var tespit edebilmektedir. Ayrıca, klonlama ile üretilen bitkilerde virüs konsantrasyonunun bilinmesi virüsten ari bitki üretiminde yol göstermektedir. Hücre kültürlerinde birden fazla virüs enfeksiyonu olduğu durumlarda, hücre kültürünün optimize edilmesinde yardımcı olmaktadır.