NÜFUS PLANLAMASI HAKKINDA KANUN’DA EŞİN RIZASININ ARANDIĞI HALLER

Os ensaios de toxicidade seguiram a Diretriz brasileira para o cuidado e

a utilização de animais para fins científicos e didáticos – DBCA, do Ministério

da Ciência, Tecnologia e Inovação, 2013. A metodologia foi realizada de acordo com as ISO 11268-1, 11268-2 e ASTM E-1676. [133]–[136]

4.3.3.1 Organismos teste

A escolha do organismo de teste, as condições para a sua manutenção em laboratório, e os requisitos para a sua utilização nos ensaios foram baseadas no protocolo ISO. [133], [134]

As minhocas Eisenia foetida são tidas como bioindicadores ambientais e são internacionalmente aceitas, já que as minhocas são organismos muito importantes no ecossistema solo além de sua sensibilidade e relativa facilidade de criação.

Os lotes de minhoca Eisenia foetida foram obtidos de produtores na cidade de São Carlos, SP, Brasil e foram conservados e mantidos no Laboratório de Química Ambiental do Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo (LQA / IQSC / USP), São Carlos, SP, Brasil, em uma mistura de latossolo vermelho seco e esterco bovino seco (50:50 v/v) em recipientes de plástico resistente (15 cm x 15 cm x 10 cm, com fundo arredondado e tampa perfurada) com uma capacidade de 1.000 g de substrato seco, a uma temperatura constante de 20 °C com foto período de 16 h/8 h de luz/escuro. Esta mistura foi umedecida periodicamente para manter o teor de umidade entre 40 e 60%. Os indivíduos utilizados nos testes foram os adultos (com presença de clitelo), com peso médio de 200 mg. A cada duas semanas, após a pesagem das minhocas, as mesmas foram alimentadas com uma colher de sopa rasa de flocos de aveia, previamente cozidas em água destilada.

Laboratório de Química Ambiental – IQSC/USP 4.3.3.2 Formulações comerciais

Glifosato® AKB 400 (Kelldrin Indústria e Comércio de Produtos Químicos e Agrícolas LTDA) é uma formulação comercial de glifosato que contém 48 g L-1 _{de princípio ativo.}

Deltamax® 25 SC (Insetimax Indústria Química LTDA) é uma formulação comercial de deltametrina que contém 25 g L-1 de princípio ativo.

4.3.3.3 Purga de minhocas em papel de filtro umedecido

As minhocas usadas nos testes de toxicidade foram lavadas em água destilada e mantidas por 24 h em recipiente fechado (com abertura na tampa) contendo papel de filtro umedecido, a fim de se fazer a limpeza de seu conteúdo intestinal.

4.3.3.4 Preparo dos vermicompostos

Resíduos constituídos a partir de casca de laranja e torta de filtro foram compostados separadamente em pilhas de 2,25 m3 (2,5 m de comprimento x 2,5 m de largura x 1 m de altura) durante 40 dias, até o processo de compostagem retornar à fase mesofílica (observado por medições de temperatura diárias). Após esse período, a casca de laranja foi misturada ao esterco bovino (2:1) em três réplicas, adicionaram-se cerca de 500 minhocas a cada réplica e o material foi vermicompostado por 135 dias. A torta de filtro foi submetida ao mesmo tratamento, porém com a razão de (3:1). A proporção de resíduos foi calculada para se obter uma razão inicial de C/N entre 20 e 30 para as pilhas. Serragem foi usada como agente estruturante e para ajudar na aeração destas pilhas. [137]

Laboratório de Química Ambiental – IQSC/USP 4.3.3.5 Montagem dos experimentos

4.3.3.5.a Glifosato

O experimento seguiu o delineamento de 1x7x5, ou seja, um tipo de tratamento (envolvendo a formulação de glifosato), em sete concentrações distintas e cinco réplicas. Foram preparadas também cinco amostras controle, o que totalizou 40 potes.

As soluções da formulação comercial utilizadas para a montagem dos testes foram nas seguintes concentrações: 96 (recomendada pelo fabricante), 3.000, 4.500, 6.000, 7.500 e 10.000 mg kg-1 a fim de simular contaminações por derramamento do herbicida.

Aproximadamente 500 g de latossolo vermelho seco foram colocados em recipientes de plástico resistente (15 cm x 15 cm x 10 cm, com fundo arredondado e tampa perfurada) e umedecidos até aproximadamente 60% de teor de umidade.

A seguir, para cada concentração, foram adicionados 10 mL de solução da formulação comercial de glifosato em cinco recipientes distintos. Foram preparados também cinco recipientes com 10.000 mg kg-1 _{com a adição de 15}

g (3%) de vermicomposto de torta de filtro. Em seguida, colocaram-se 10 minhocas adultas e tamparam-se os recipientes.

4.3.3.5.b Deltametrina

O experimento seguiu o delineamento de 2x6x5, ou seja, dois tipos de tratamento (um envolvendo a formulação comercial de deltametrina e outro envolvendo a formulação comercial contendo apenas os dispersantes, fornecida pelo fabricante), em seis concentrações distintas e cinco réplicas. Foram preparadas também cinco amostras controle, o que totalizou 65 potes.

As soluções da formulação comercial utilizadas para a montagem dos testes tiveram as seguintes concentrações: 5 (recomendada pelo fabricante), 100, 250 e 500 mg kg-1 _{a fim de simular contaminações por derramamento do}

Laboratório de Química Ambiental – IQSC/USP Aproximadamente 500 g de latossolo vermelho seco foram colocados em recipientes de plástico resistente (15 cm x 15 cm x 10 cm, com fundo arredondado e tampa perfurada) e umedecidos até aproximadamente 60% de teor de umidade.

A seguir, para cada concentração, foram adicionados 10 mL de solução da formulação comercial de deltametrina em cinco recipientes distintos. Foram preparados também cinco recipientes com 500 mg kg-1 com a adição de 15 g (3%) de vermicomposto de torta de filtro e outros cinco recipientes com 500 mg kg-1 com a adição de 15 g (3%) de vermicomposto de bagaço de laranja. Em seguida, colocaram-se 10 minhocas adultas e tamparam-se os recipientes.

4.3.3.6 Ensaios de Toxicidade Aguda (Mortalidade) e Ganho de Biomassa

Nos dias 0, 7, 14, 21 e 28, as minhocas foram retiradas dos potes, lavadas em água corrente, secas e pesadas. Para a toxicidade aguda, foram avaliadas as mortes das minhocas ocorridas nas duas primeiras semanas, ou seja, até o 14º dia.

A mortalidade foi determinada por contagem do número de minhocas mortas. As minhocas foram consideradas mortas quando não apresentavam movimento nem respondiam a nenhum estímulo tátil. Como as minhocas tendem a se desintegrar rapidamente, em caso de falta de alguma minhoca, elas foram consideradas mortas. Os valores de DL20 foram calculados usando

o programa de modelagem PriProbit ® usando os dados de mortalidade.

Para o estudo do ganho de biomassa, foram calculadas e analisadas as porcentagens de ganho/perda de biomassa total e entre cada semana até o 28º dia. Semanalmente, monitorou-se a umidade em cada pote.

4.3.3.7 Ensaios de Reprodução

O ensaio de reprodução foi feio posteriormente ao ensaio de ganho de biomassa. Após o 28º dia, as minhocas sobreviventes foram retiradas dos potes e o monitoramento de umidade (60%) continuou até o 56º dia. Neste dia, realizou-se a contagem de casulos, ovos e/ou minhocas jovens.

Laboratório de Química Ambiental – IQSC/USP 4.3.3.8 CL20

Os valores de concentração letal (CL20) foram calculados pelo programa

Priprobit®, um software produzido pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, disponível para download em

<http://www.ars.usda.gov/services/docs.htm?docid=11284>.

Os dados foram organizados em arquivos txt em três colunas (concentração, sobreviventes e mortos), em que os valores usados foram a soma dos sobreviventes/mortos nas cinco réplicas. Em seguida, a tabela foi salva e realizou-se o cálculo de DL20 de acordo com as instruções do software.