4.7.1 RIFI
A técnica de imunofluorescência indireta foi realizada de acordo com Camargo (1966). Foram utilizadas microplacas para a diluição dos soros nas proporções 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e assim sucessivamente. A diluição inicial utilizada foi de 1:40. Em lâminas fixadas com antígenos de Leishmania major, obtidas de cultivo em meios de LIT e NNN, repicadas semanalmente, foram distribuídos 10 µl de cada diluição nos orifícios, incubando-se a 37 oC por 30 minutos em câmara úmida.
A seguir, foram lavadas em coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, por duas vezes consecutivas, e depois secas em estufa. O conjugado espécie-específico foi diluído, segundo seu título pré-estabelecido, em solução de Azul de Evans a 20 mg% a qual foi previamente diluída em PBS 7,2 na proporção de 1:5. Foram distribuídos 10 µl de conjugado para cada diluição, incubando-se novamente a 37 oC por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se nova lavagem em coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, duas vezes consecutivas, secando-se em estufa. As lâminas foram montadas com glicerina tamponada pH 8,5, cobrindo-se com lamínula 24mmX60mm, examinando-se em microscópio de imunofluorescência com aumento 40X. Após a leitura dos controles, foi procedido o exame das amostras em teste, considerando como título final a maior diluição do soro em que ainda ocorria fluorescência completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas.
O antígeno foi preparado a partir de formas promastigotas de L. major, mantidas em tubos rosqueados contendo 10 mL de meio LIT e cinco mL de meio NNN. O repique para manutenção da amostra foi realizado semanalmente. Foi avaliado o crescimento das formas promastigotas e do tubo que apresentou parasitos com melhor motilidade e em maior quantidade, repicou-se 0,5 ml para três novos tubos de meio, procedendo-se, assim uma nova passagem. Os tubos foram mantidos em estufa a 25oC. Em seguida, centrifugou-se 10 ml de LIT a 3000 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o sobrenadante e adiciona-se de 2 a 3 ml de solução salina tamponada 0,01M pH 7,2, centrifugando-se novamente a 3000 rpm por 10 minutos, desprezando-se o sobrenadante. O processo deve ser repetido por mais três vezes. Os parasitos foram quantificados em microscopia óptica e utilizados como antígeno quando se obteve de 20 a 30 parasitos por campo.
As lâminas foram preparadas pipetando-se 10 µl da suspensão de promastigotas em cada um dos orifícios, retirando-se em seguida por aspiração, restando somente uma fina película sobre cada orifício. As lâminas foram secas em temperatura ambiente, e mantidas em laminário à -20oC, até o momento do uso, por período máximo de duas semanas.
4.7.2 TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
4.7.2.1 PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO (L. major)
Os parasitos foram cultivados em 40 ml de meio LIT inoculados com 10 mL do repique de cultura anterior, durante sete dias em garrafa de ROUX de um litro, mantida a 25 oC na posição horizontal. O conteúdo da garrafa foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos em tubo falcon. O sobrenadante foi desprezado e na seqüência foi adicionado 10 ml de PBS homogeneizando-se, centrifugando-se como anteriormente, repetindo-se essa operação por mais duas vezes. A seguir, o sedimento foi homogeneizado em 10 ml de PBS estéril e congelado a -20oC por 24 horas. As formas promastigotas suspensas foram mantidas a -80oC, até o momento da sonicação. Após o descongelamento, a sonicação foi realizada em ciclo de 50%, a 4oC por 30 segundos por seis ciclos, analisando-se ao microscópio para observar se as formas promastigotas foram quebradas em pequenos fragmentos. O material obtido foi imediatamente centrifugado a 5000 rpm por 15 minutos sob refrigeração a 4oC, e o sobrenadante resultante foi utilizado como antígeno, no qual foi adicionado PMSF (Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride) 1mM, que é um inibidor de protease para a conservação das proteínas. Aliquotou-se em frascos para congelamento. A dosagem de proteína foi realizada pelo método de Lowry (1951). O antígeno foi testado com amostras de soro de cães sabidamente positivos e negativos, para testar sua viabilidade.
4.7.2.2 SENSIBILIZAÇÃO DAS PLACAS DE ELISA
Para a sensibilização das placas de ELISA de poliestireno, de fundo chato, foram utilizados três microgramas de antígeno por poço, totalizando 300 microgramas por placa. As mesmas foram mantidas em câmara úmida sob refrigeração, de um dia para o outro e posteriormente lavadas quatro vezes com solução de lavagem. Após secagem, foram incubadas com 150 µl de PBSC (tampão bloqueio) por uma hora em estufa a 370C. Desprezou-se o tampão e a placa foi lavada quatro vezes com solução de lavagem e secas. Os soros testes e os controles foram diluídos em solução PBSCT a 1:80. Após as diluições, a placa permaneceu na estufa 370C por 30 minutos. Foi lavada quatro vezes com solução de lavagem para retirada do excesso de soro e secas. O conjugado imunoenzimático utilizado foi uma antiimunoglobulina de cão, fração IgG, marcada
com peroxidade (Sigma-Company USA), previamente titulado com soros e conjugado já conhecidos. Após o preenchimento de cada poço com 100µl da solução de PBSCT e conjugado, a placa foi incubada por 30 minutos a 37oC e a seguir lavadas com solução de lavagem por quatro vezes. Foram adicionados 100µl de substrato (5mg de -O-fenilenodiamino -OPD + 4µl de água oxigenada a 30% + 10ml de tampão citrato-fosfato) por orifício, e a placa foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Foram adicionados 30µl/orifício de ácido sulfúrico (H2SO4) 4N para interromper a reação. A leitura foi feita em leitor de ELISA a 492nm. Os resultados foram expressos em valores de densidade óptica (DO).
4.7.2.3 CÁLCULO DO PONTO DE CORTE
Utilizou-se a seguinte fórmula para o cálculo do ponto de corte:
CO = média CN x 2 x 1,2 Onde: CO = Cut-Off
média CN = média da densidade óptica dos orifícios do controle negativo 2 = fator de correção
1,2 = número multiplicado ao valor do cut-off para embutir a zona cinza no ponto de corte
O ponto de corte foi calculado para cada reação, utilizando os resultados das densidades ópticas obtidos de três controles negativos. Esse cálculo é utilizado para a realização do ELISA com o kit EIE-leishmaniose canina-Bio- Manguinhos, segundo o seu respectivo manual. Igualmente, Machado et al. (2007) utilizou o mesmo procedimento para calcular o ponto de corte. Como no presente estudo, Marchi et al. (2007) estabeleceram o ponto de corte do ELISA para cada reação realizada, utilizando a média aritmética de três controles negativos adicionada de um fator de correção.
Há outras maneiras de se calcular o ponto de corte para a prova de ELISA. No teste de triagem de cães sorologicamente positivos, o ponto de corte foi estabelecido pela determinação das densidades ópticas utilizando-se a curva ROC (Receiver Operating Characteristics), desenhada com os valores de absorvância obtidos com os soros de 30 cães comprovadamente positivos para
a infecção por L. chagasi, em testes sorológicos e parasitológicos, e de 71 cães sadios, não infectados, provenientes de áreas não-endêmicas (AGUIAR et al.; 2007).