Monitör: LG 52 ekran monitör 7) Kamera ve video

Genel anestezi eşliğinde hastaya spekulum uygulaması ardından vajen batticon solüsyonla temizlendi ve tenekulum ile tutuldu. İşleme direkt monitörden gözlemle serviks ve servikal kanalın degerlendirilmesi ile başlandı. Daha sonra

25

internal os geçilerek uterin kavite panaromik olarak incelendi. Her iki tubal ostium tek tek değerlendirildi. Tüm uterin kavite duvarları ayrıntılı olarak değerlendirilerek işleme son verildi. İşlem sırasında gözlenenler histeroskopi kayıt formuna ve histeroskopi defterine kayıt edildi. H/S de kullandığımız tüm aletler 20 dakika gluteraldehit solusyonunda bekletildikten sonra serum fizyolojik ile yıkandı. Distansiyon mediası olarak %0,9 izotonik NaCl kullanıldı. Yeterli intrauterin basıncın sağlanması için manşonlu infuzyon pompasından faydalanıldı. Histeroskopi işlemi, konuda tecrübeli cerrah tarafından asistan doktorların eşliğinde uygulandı. Yapılan tüm histeroskopi işlemlerinin görüntüleri bilgisayar ile kayıt altına alındı. Hasta istediği takdirde DVD‟ye kopyalanarak hastaya verildi.

H/S sırasında küret ile uterus corpus posterior endometriyumdan biyopsi yapıldı. Sağlıklı gönüllüler için bu işlem hali hazırda yapılması planlanmış olan jinekolojik operasyon sırasında gerçekleştirildi. Alınan biyopsiler aynı cerrah tarafından iki eşit parçaya ayrılarak iki ayrı steril biyopsi kaplarına konuldu. Immunohistokimyasal incelemeye gidecek olan biyopsi materyali formalin fiksatif içine konulup işlem sonrası derhal patoloji birimine ulaştırıldı. Diğer biyopsi materyali ise %2,5‟luk gluteraldehit solusyonu içerisinde işlem sonrası derhal elektron mibroskobi birimine ulaştırıldı.

Histeroskopi sonrası hastalar, serviste iki saat vaginal kanama takibine alındı. Tüm hastalar herhangi bir komplikasyon oluşmadan poliklinik kontrolü önerilerek taburcu edildi.

Ġmmunohistokimyasal inceleme:

Tüm vakalar (62 adet: 50 hasta + 12 kontrol) formalin içinde patoloji kliniğine ulaştırıldı. İmmunohistokimyasal boyama öncesi tüm spesmenler genel patolojik inceleme için uygun alanları doku takibinden sonar parafin bloklar hazırlanarak Hematoksilen-Eosin ile boyandı. Hazırlanan preparatlardan patolojik tanı ve Noges yöntemi uygulanarak endometriyal günleme yapıldı. Yeterli doku bulunmayan, luteal faz dönemine uymayan preparatlar belirlenerek çalışma dışı bırakıldı. Toplam 59 vaka olmak üzere 48 hasta ve 11 kontrol grubu oluşturularak immünohistokimyasal boyama için eski parafin bloklardan tekrar üçer kesit alındı. Olgulara ait 3 µm‟ lik parafin kesitler bir gece etüvde 60ºC‟ de bekletildi. Konsante olan tüm antikorlar

26

uygun yüzdelerle dilüe edildi. Tüm vakalardan birbirinin aynısı üç grup oluşturuldu. Birinci gruptaki spesmenler Annexin A1 poliklonal antikoru (1:500, Thermo Fisher, Ltd, USA) ile, ikinci gruptakiler NP-1 poliklonal antikoru (1:25, Thermo Fisher, Ltd, USA) ile, üçüncü gruptakiler de Osteopontin poliklonal antikoru (1:50, Thermo Fisher, Ltd, USA) ile boyanmak üzere tam otomatik kapalı sistem VENTANA BENCHMARK XT ile çalışıldı. Boyama işlemi bittikten sonra lamlar yıkama işlemine alındı. Lamlar yıkandıktan sonra alkol serilerinden geçirildi ve lamlar oda koşullarında kurumaya bırakıldı. Ardından ksilen solusyonundan geçirilip entellan damlatılarak lamelle kapatıldı.

Mikroskobik inceleme:

Rastgele seçilen preparatlar hasta veya kontrol grubu olduğu bilinmeden tek patolog tarafından değerlendirildi. Değerlendirmenin yapılacağı alan tespiti için x40 (x10 oküler lensile x4 objektif lensi) ve x100 (x10 oküler lens ile x10 objektif lensi) büyütmeli (Nikon Ecclipse E200, Tokyo, Japonya) mikroskop kullanıldı. Preparatların görüş alanı içerisindeki endometriyum yüzey epiteli, endometriyum gland epiteli ve endometriyum stroması örnek bir çalışmanın skorlama sistemi kullanılarak değerlendirildi (88).

Ġmmünohistokimyasal skorlama:

Annexin 1, NP-1 ve Osteopontin ekspresyonlarının yoğunluğu semikantitatif bir skorlama sistemi kullanılarak yapıldı (88). Bu skorlama için kullanılan skala 0 ile 3 arasında puan verilerek yapıldı. 0: negatif, boyanma hiç yok; 1: zayıf boyanma; 2: orta dereceli boyanma; 3: güçlü boyanma. Böylece skor 0 ve 1 düşük dereceli ekspresyon; skor 2 ve 3 ise yüksek dereceli ekspresyon olarak değerlendirildi.

27

ġekil 2: ANXA-1 ile boyanmış patoloji spesmenleri (foto 1: skor 1, az boyanma, yüzey epitelinde boyanma belirgin; foto 2: skor2, orta dereceli boyanma, yüzey ve gland epitelinde boyanma belirgin; foto 3: skor 3, iyi boyanma, gland ve stromal boyanma belirgin) (foto 1X4, foto 2X4, foto 3X10)

28

ġekil 3: NP-1 ile boyanmış patoloji spesmenleri (foto 1: skor 1, az boyanma, yüzey ve gland epitelinde boyanma belirgin; foto 2: skor2, orta dereceli boyanma, gland epitelinde boyanma belirgin; foto 3: skor 3, iyi boyanma, her alanda boyanma belirgin) (foto 1X10, foto 2X10, foto 3X4)

29

ġekil 4: OPN ile boyanmış patoloji spesmenleri (foto 1: skor 1, az boyanma, yüzey epitelinde boyanma belirgin; foto 2: skor2, orta dereceli boyanma, yüzey ve gland epitelinde boyanma belirgin; foto 3: skor 3, iyi boyanma, her alanda boyanma belirgin) (foto 1X4, foto 2X4, foto 3X4)

30 Scanning elektron mikroskobik inceleme:

Endometrium doku örnekleri, taramalı elektron mikroskobu için % 2,5‟luk gluteraldehitli solusyonda tespit edildikten sonra, sodyum fosfat tamponda yıkandı ve rutin elektron mikroskopi takip işlemlerinden geçirildi. Kritik noktada kurutulan örnekler, stamplara yerleştirildi ve altınla kaplandı. Alan Taramalı Emisyon Mikroskobunda (FESEM-Carl Zeiss, Supra 40 VP) incelenen örneklerin mikrografları alındı (X3000 ve X5000 orijinal büyütme).

SEM skorlama:

Örneklerin fotoğraflarından pinopod yoğunluğu, bu konuda yapılmış bir çalışmanın skorlama sistemi örnek alınarak değerlendirildi (89). (Skor 0= hiç pinopod yok, Skor 1= pinopod yerleşimi <%20 alan, Skor 2= pinopod yerleşimi %20-50 alan, Skor 3= pinopod yerleşimi >%50 alan). Örneklerin aynı fotoğraflarından pinopod morfolojisi de yine aynı çalışmada yapılan bir diğer skorlama sistemi kullanılarak değerlendirildi. (skor 0= hiç pinopod yok, Skor 1= büyüyen pinopod, Skor 2= tamamen büyümüş pinopod, Skor 3= büzülmüş pinopod.)

31

ġekil 5: Scanning elektron mikrografları (foto 1: pinopod gelişimi hiç olmayan bir endometriyum, foto 2: yeni gelişmekte olan pinopodlar alanın %20‟sinden azında oluşmuş, foto 3: iyi gelişmiş pinopodlar alanın %20-50‟sinde oluşmuş, foto 4: regrese olmuş pinopodlar alanın %50‟sinden fazlasında oluşmuş) (tüm fotolarX3000)

Histeroskopi bulgularının değerlendirilmesi:

Histeroskopi bulguları, DVD kayıtlarından midsekretuar dönemde yapılmış bir histeroskopi yazısındaki değerlendirme referans alınarak puanlandı (90). Tüm endometriyum boyunca yuvarlak tip gland açılımları ve kalın vasküler oluşumlar iyi endometriyum olarak değerlendirilirken; nokta tip gland açılımları ve ince vasküler oluşumlar kötü endometriyum olarak değerlendirildi .

ġekil 6: Histeroskopi görüntüleri (foto1: nokta tip gland açılımları ve ince vasküler oluşumlar, kötü endometriyum; foto 2: yuvarlak tip gland açılımları ve kalın vasküler oluşumlar, iyi endometriyum)

32

Elde edilen değerlerin istatistiksel analizinde SPSS programı kullanıldı. Tanımlayıcı veriler için aritmetik ortalama, standart sapma ve yüzde dağılımları yapıldı. Karşılaştırmalı tablolarda parametrik yöntemler kullanıldı. Tüm verilerde anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edildi.

Bu tez çalışması için 19.12.2013 tarihli ve 60116787-020/52791 nolu etik kurul onayı alınmıştır.

33

BULGULAR

USG ĠLE DEĞERLENDĠRĠLEN ENDOMETRĠYAL KALINLIK