Moleküler Tanıda Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Moleküler tanı yöntemlerinin temelini nükleik asit kimyası ve yapısal özellik- lerinin tespitine yönelik çalıĢmalar oluĢturmuĢtur. DNA ilk olarak 1870 yılında Tubingen‟de kimya öğrencisi Friederich Miescher tarafından tanımlanmıĢtır. ABD‟den J.D. Watson ile Ġngiliz Francis H.C.Crick (1953) DNA‟nın çift sarmallı heliks yapısını ve komplementer özelliğini keĢfetmiĢlerdir. Böylece nükleik asitlerin kimyası ve yapı elemanları hakkındaki çalıĢmalar yoğunlaĢmıĢtır. K.B.Mullis‟in 1983‟te Thermus aquaticus‟dan izole edilen ısıya dayanıklı taq DNA polimerazı, polimeraz zincir reaksiyonu tekniğinde baĢarı ile uygulaması, spesifik DNA dizileri- nin in vitro Ģartlarda çoğaltılmasını mümkün hale getirmiĢtir. Hedef DNA/RNA dizi- lerinin çoğaltılması ve tanımlanmasını, modifiye PZR bazlı, daha duyarlı ve özgül yöntemlerin geliĢtirilmesine yönelik çabalar izlemiĢtir(113).

Nükleik asit amplifikasyon (NAA) teknolojisi, nükleik asit teknolojisinin en kompleks ve duyarlı olanıdır. PZR olguda az sayıda bulunan viral nükleik asitin (DNA/RNA) miktarını artırmayı amaçlar. Virüsün çoğaltılmak istenen özgül DNA segmenti hedef alınır. Çıkarılması amaçlanan özgül DNA segmentinin iki ucu için yaklaĢık 20 bazlık özgül nükleotid dizileri (primerler) kullanılır. Bu Ģekliyle pimerler biyolojik parantezlere benzetilebilir. PZR‟ de primerlerin viral DNA‟ ya tutunup kar- Ģıt sarmalı sentezleyebilmesi için serbest nükleotidlere ve ısıya dirençli tag DNA polimeraz enzimine gereksinim vardır. Bu karıĢım bir ısı düzenleyicisinin içine ko- nur. Isı, önce 90-95 0_{C‟ ye çıkarılarak DNA segmentleri ayrılır, sonra ısı 50-60} 0_C‟

ye kadar düĢürülerek primerlerin hedeflerine tutunması sağlanır. Ardından ısı tekrar 72 0C‟ ye yükseltilerek orijinal DNA‟ ya tutunmuĢ primerlerin 5‟- 3‟ yönünde uza- ması sağlanır. Hedef DNA dizisinin bir kopyasının oluĢmasıyla sonuçlanan bu iĢlem 30-40 kez yinelendiğinde amplikon adı verilen çok sayıda PZR ürünü elde edilmiĢ olur. RNA genomu olan virüslerde PZR iĢleminden önce reverz transkripsiyonla komplementer DNA‟ nın (cDNA) elde edilmesi gerekir. Bu yönteme ise RT-PZR denilmektedir. Duyarlılığı artırıcı nested PZR, birden çok viral genomu saptayıcı multipleks PZR gibi farklı ve yeni uygulamalar da bulunmaktadır (113,114).

Çoğu NAA yönteminde, ortaya çıkan amplikonu tesbit için nükleik asit probları ve agaroz jelde amplikonların etidyum bromidle boyanarak gösterilmesi yoluna gidilmektedir. NAA tekniklerinin, prob hibridizasyon testlerine göre en önemli avantajı daha analitik olmalarıdır. Prob hibridizasyon testleri ile gösterileme- yen, hatta kültürde izole edilemeyen miktarlardaki mikroorganizma, amplifikasyon yöntemleri ile gösterilebilir. Üstelik sadece prodüktif virüsleri saptayabilen immünohistokimyasal yöntemler karĢısında latent dönemdeki virüsleri de saptaya- bilmesi önemli bir üstünlüktür (108,113,114).

Ayrıca çoğaltma testlerinde olgu kullanımı sınırlı değildir. Ġnfekte her türlü materyal tanı amacı ile kullanılabilmektedir. Her türlü materyalin olgu olarak değer- lendirilebildiği, hedef genlerin veya nükleik asitlerin in vitro Ģartlarda çoğaltılabil- mesi ve tanımlanmasına imkan sağlayan bu yöntemler, normal gen yapısının analizi- nin yanı sıra genlerdeki insersiyon, delesyon ya da nokta mutasyonlarının gösterile- bilmesine de yardımcı olmaktadır (113).

Yoğun olarak kullanıma giren NAA yöntemlerinin; DNA/RNA üzerindeki spesifik gen bölgelerinin hedef alındığı hedef çoğaltma yöntemleri, hedef ile hibridize olan probların çoğaltıldığı prob çoğaltma yöntemleri ve hedef gen bölgesini

tanıyan iĢaretli problar ile hedefle hibridizasyon sonrası sinyalin güçlendirildiği sin- yal çoğaltma yöntemleri olmak üzere üç modifikasyonu kullanılmaktadır (113).

Hedef NAA yöntemleri içerisinde ilk ve en önemli olanı PZR„dir. PZR tıbbi araĢtırma alanlarının birçoğunda önemli kullanım alanı bulmuĢtur. Özellikle mikro- biyolojide müĢkülpesent veya kültürü yapılamayan birçok mikroorganizmanın doğ- rudan tanısında oldukça baĢarı sağlamaktadır. Amplifikasyon metodları günümüzde, amplifiye ürünlerin hızlı tesbitini sağlayan metodlarla kombine olarak kullanılmak- tadırlar. (113).

PZR, nükleik asitlerin in vitro Ģartlarda replikasyonu için geliĢtirilmiĢ bir test tüp sistemidir. Hedef DNA/RNA‟nın selektif olarak çoğaltılmasına imkan verir. Ġn vivo Ģartlarda bölünen bir hücrede DNA‟nın replikasyonu, çeĢitli enzimler tarafından düzenlenen ve genomun kopyalanması ile sonuçlanan bir iĢlemdir. Bir test tüpü içe- risinde gerçekleĢtirilen PZR‟de in vivo çoğalma olgu olarak alınmıĢtır. Yanlızca DNA polimeraz enzimi yardımı ile genomun tamamı değil spesifik bölgelerin kopya- lanması gerçekleĢtirilir. (113).

Bir PZR döngüsü Ģu aĢamalardan oluĢur (ġekil 7).

1-Ayrılma (Denatürasyon): Çift iplikli DNA‟nın birkaç saniye 94-96 0C ısı ile

tek iplikli DNA‟ya ayrılmasıdır.

2-Bağlanma (Annealing): Örneğin, birkaç dakika 30-60 0C de tutularak, primerlerin (spesifik sentetik oligo nükleotidler) tek sarmal DNA‟daki hedef bölge- lere hibridizasyonunun sağlanmasıdır. Bu hidrojen bağlarının yardımı ile olur. Bağ- lanma ısısı sadece DNA/DNA eĢleĢmesine imkan sağlayacak kadar yüksek olmalıdır.

3-Uzama (Extansion): Polimeraz enzimi yardımı ile tek sarmal DNA kalıpla-

rına bağlanan primerlerin 5‟→3‟ yönünde uzatılmasıdır.

DNA zincirinin komplementerini sentezlemesi için 65-72 0_{C de birkaç dakika}

beklenir. Bağlanma sikluslarını takiben, orijinal DNA segmenti yeni komplementer DNA‟lar ve yeni kalıp DNA‟lar oluĢturur. Böylece her PZR döngüsünde mevcut özgün DNA miktarı 2 katına çıkmaktadır. Bu iĢlem 30-40 kez tekrarlanarak çok sa- yıda hedef DNA eldesi mümkün hale gelir (113,114).

Şekil-7: Bir PZR döngüsünün aĢamaları (115).

Çoğaltmadan sonra PZR ürünleri genellikle agaroz jel üzerindeki kuyucuklara yüklenir ve daha sonra elektroforeze tabi tutularak oluĢan bantlar 270 nanometre dalga boyu ıĢık altında değerlendirilir (113).

4.GEREÇ ve YÖNTEM