Moleküler karakterizasyon bulguları ve sonuçların değerlendirilmesi

Bu çalışmada, yıldız çiçeği türlerine ait genotiplerin ISSR markörleri yardımıyla genomik düzeyde farklılığının tespit edilmesi amaçlanmıştır. Ön testlemelerde toplam 20 adet ISSR primeri denenmiş, bu primerlerden 13 tanesi fonksiyonel ve skorlanabilir DNA fragmenti üretmiştir. Dominant karakter gösteren ISSR markörleri ile PCR’da çoğaltılan amplikonların agaroz jelde yürütülmesi sonucunda, jel görüntülerinden elde edilen bantları var/yok (1/0) şeklinde skorlanarak excel dosyalarına kaydedilmiştir. Skorlanmış DNA fragmentlerine göre 11 adet ISSR primerin polimorfizm yüzdesi %100’dür. M2 primerinin %80, M15 primerinin ise %33’tür. Skorlanmış bu DNA fragmentlerine göre tüm bitkilerde toplam polimorfizm yüzdesi %96.97’dir. Çizelge 4.7’de görüldüğü gibi 13 adet ISSR primerinden toplam 99 adet fragment skorlanmış ve bunlardan 96 adedinin polimorfik karakterde olduğu görülmüştür.

Çizelge 4.7. Yıldız çiçeği genotiplerine ait polimorfizm verileri

Primer ismi

(ISSR) Skorlanan toplam bant sayısı Polimorfik bant sayısı Polimorfizm yüzdesi

M1 6 6 100 M2 5 4 80 M3 12 12 100 M5 7 7 100 M7 5 5 100 M8 9 9 100 M9 10 10 100 M10 5 5 100 M15 3 1 33.33 M16 11 11 100 F1 8 8 100 F3 9 9 100 F4 9 9 100 Toplam 99 96 96.97

Zhao ve ark. (2007), Çin’de doğal yayılış gösteren bir bitki olan Chimonanthus praecox (L.)’de ISSR ve RAPD markörleri ile genetik çeşitliliği belirlemeye çalışmışlar ve polimorfizmin tespitinde, ISSR markörlerinin RAPD markörlerine göre daha başarılı bir dominant markör olduğunu bildirmişlerdir.

makarnalık buğdaylarında ISSR markörlerinden faydalanarak genetik çeşitliliği tespit etmeye çalışmışlar ve kullandıkları 18 primerden %98.5 ile %96.3 arasında değişim gösteren polimorfizm olduğunu belirlemişlerdir.

Benzer bir çalışmada, ISSR markörlerinden faydalanılarak, Türkiye’de doğal olarak bulunan Linum bienne Mill. (keten)’de moleküler karakterizasyonun yapıldığı bir çalışmada, toplam 292 adet DNA bandından 275 adedinin polimorfik olduğu belirlenmiştir (Uysal, 2013).

Genotipler arasındaki uzaklığın belirlenmesinde, temel karşılaştırma (simple matching) benzerlik katsayısı kullanılmış ve benzerlik matrisleri oluşturulmuştur. Elde edilen bu benzerlik matrisleri kullanılarak, NTSYSpc-2.10d (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (Sayısal Taksonomi ve Çok Değişkenli Analiz Sistemi) paket programında ağırlıklı olmayan aritmetik ortalama eş grup metoduna (UPGMA: Unweighted Pair Group Method using ArithmeticAverage) göre kümeleme (cluster) analizi yapılmıştır. Daha sonra genotiplere ait dendrogram oluşturulup, iki boyutlu ölçekleme ve temel koordinatlar analizi (Principal Coordinate Analysis) yapılmıştır.

Ntsys-PC paket programında polimorfik DNA fragmentlerinin skorlanmasıyla elde edilen binary matriksinde Simple Match benzerlik katsayısına göre, SAHN prosedürü ile kümeleme analizi gerçekleştirilmiştir. Bu analiz sonucunda genotiplerin birbirinden ayrıldığını gösteren bir dendrogram elde edilmiştir (Şekil 4.2.). Dendrogram, genotipler arasındaki genetik ayrışma değerinin oldukça yüksek olduğunu göstermektedir. Genotipler arasındaki polimorfizm oranı çok yüksek olup; bu değerler 0.64 ile 0.93 arasında bulunmaktadır.

Kendi aralarında yüksek bir polimorfizm göstermiş olan yıldız çiçeği genotipleri, Temel Koordinatlar Analizi sonucunda Minitab’da oluşturulan Scatterplot grafiğinde yoğun bir gruplaşma göstermemiştir. Bu da bitki genotipleri arasındaki farklılığın zenginliğine işaret etmektedir. Minitab programı temel koordinatlar analizinde, Ntsys programından daha kuvvetlidir. Bu yüzden verilerin değerlendirilmesinde Ntsys programı ile elde edilen dendrogram ve Minitab’ta gerçekleştirilen Temel Koordinatlar Analizi sonucunda elde edilen Scatterplot grafiği baz alınacaktır.

Minitab16 programında UPGMA metoduna göre elde edilen matrixplot grafiği Şekil 4.3.’de verilmiştir. Ntsys-PC programı ile UPGMA metoduna göre 2 boyutlu ve 3

boyutlu çizilen grafikler Şekil 4.4 ve Şekil 4.5’te verilmiştir. Şekil 4.6, 4.7 ve 4.8’da farklı primerlerle tarama sonucu elde edilmiş olan jel görüntüleri verilmiştir.

Şekil 4.2. Temel benzerlik katsayısı (Simple Matching) kullanılarak yıldız çiçeği türlerine ait

genotipler arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koyan dendrogram

Şekil 4.3. Yıldız çiçeği türlerine ait genotipler arasındaki ilişkiyi gösteren, Minitab16 programı

Şekil.4.4. Yıldız çiçeği türlerine ait genotipler arasındaki ilişkiyi gösteren, Ntsys-PC paket

programı ile elde edilen 2 boyutlu matrix plot grafiği

Şekil.4.5. Yıldız çiçeği türlerine ait genotipler arasındaki ilişkiyi gösteren, Ntsys-PCR paket programı ile

Şekil 4.6. M16 markörü ile yıldız çiçeği türlerine ait genotiplerde yapılan PCR çalışmasının jel görüntüsü

Şekil.4.7. M5 markörü ile yıldız çiçeği türlerine ait genotiplerde yapılan PCR çalışmasının jel görüntüsü

Şekil.4.8. M9 markörü ile yıldız çiçeği türlerine ait genotiplerde yapılan PCR çalışmasının jel görüntüsü

Bu çalışmada dış grup bir bitki kullanılmamıştır. Ama yapılan analiz sonucunda 18 numaralı bitki bir dış grup bitkiymiş gibi hareket etmiştir. Keza bitkinin çiçek yapısı diğer bitkilerden farklılık göstermektedir. Olası bir ıslah programında bu bitkilerin kullanılması planlandığında 18 numaralı bitki dış grup olarak değerlendirilebilir. Oğraş ve ark. (2017), benzer şekilde gül bitkisinde ISSR markörü yardımıyla yaptıkları çalışmada, dış grup bitki kullanmadan veri analizini gerçekleştirmişlerdir.

Dendrogramda en az ayrışma gösterdiği gözlemlenen genotiplerin, Temel Koordinat Analizi (PCoA) sonucunda da birbirlerine yakın konumlandığı tespit edilmiştir. Dendrogram ve PCoA’dan elde edilen veriler, birbirlerine uyum

ile desteklenmektedir.

Genetik ayrışım, dendrogramda 0.63 ile 0.96 aralığında görülmektedir. Bu da PCoA analizinde kendini gösteren dağınık dağılımı ve genetik havuzun büyük olduğunu doğrulayacak niteliktedir. Bitkiler 2’li 3’lü 5’li gruplar oluşturmuştur.

Yapılan bu analizlerde kullanılan primerler, diziye özgü tasarlanmış primerler değildir. Daha fazla sayıda ISSR primerinin genotiplerde taramasının gerçekleştirilmesi ile dendrogramdaki gruplaşmalar değişebilir. Daha fazla sayıda polimorfik bandın üretilmesi, gruplaşmaların daha keskinleşmesine yardımcı olabilir. Ayrıca literatürde ISSR markörlerinden elde edilen verilere ek olarak RAPD markörleri ile yapılacak taramadan elde edilecek verilerin kombinasyonu ile bitkilerin genetik ayrışmasının daha güvenilir olduğunu belirten çalışmalar da bulunmaktadır (Saraçoğlu, 2007; Kayis ve ark., 2010).

4.3. Yıldız Çiçeği Çeşitlerinde Bitki Büyüme Düzenleyici Maddeler ile İlgili