3. MIMO SĐSTEMLER VE ÇOKLU ANTEN KULLANIMI
3.3 MIMO Çeşitleme ve Çoklama Teknikleri
Na família Picornaviridae, a peptidase Lbpro (E.C. 3.4.22.46) é encontrada
apenas no gênero Aphthovirus como mostra a FIGURA 11 abaixo.
FIGURA 11. Representação do processamento primário dos seis gêneros da família Picornaviridae. Adaptado de Seipelt et al., 1999.
A primeira proteína a ser traduzida do genoma viral do FMDV é a Lbpro
(FIGURA 12A). No genoma de todos os sorotipos de FMDV existem dois códons de iniciação AUG, separados por 84 nucleotídeos, traduzindo duas formas da peptidase leader: Labpro e Lbpro. Essas duas formas da peptidase leader são encontradas in
vivo e possuem as mesmas propriedades enzimáticas in vitro (Medina et al., 1993). A Lbpro é liberada da poliproteína viral através de uma auto-clivagem entre
a sua própria região carboxi-terminal e a região amino-terminal da proteína VP4 entre os aminoácidos K e G da seqüência KVQRKLKGAGQSS de maneira intra ou
intermolecular como mostra a FIGURA 12 B.
[--- -][---] Precursores do Precursores não estruturais Capsídeo
FIGURA 12. Atividade biológica da Lbpro. A) RNA viral. B) Autoclivagem da Lbpro na poliproteína viral. C) Clivagem do eIF4G. Adaptado de Guarné et al., 1998.
Em eucariotos superiores, a tradução proteica se inicia a partir da montagem do ribossomo junto ao RNA mensangeiro (mRNA), com a participação de fatores de iniciação da tradução (eIF). Dentre esses, se destacam aqueles que formam o complexo eIF4 (eIF4A, eIF4E e eIF4G), que permitem a associação da subunidade
Após o processo de auto-clivagem na poliproteína viral, a Lbpro cliva o fator
eucariótico de iniciação da tradução do hospedeiro, o eIF4G (FIGURA 12C). Essa clivagem resulta na supressão da tradução dos RNA mensageiros (mRNA) do hospedeiro e na tradução dos mRNAs virais independente da estrutura 7-metil- guanosina (Cap 5’) , ou seja, por meio do sítio de entrada interna do ribossomo (Guarné et al., 1998).
A Lbpro cliva duas isoformas do eIF4G na célula hospedeira. A clivagem
do eIF4GI ocorre entre os resíduos de aminoácidos G e R da seqüência FANLGRTT , e entre Ge S da seqüência LLNVGSRRTT no eIF4GII ( Kuehnel et al., 2004).
Um vírus mutante do sorotipo A12 da febre aftosa, denominado de leaderless virus 2 (LLV2), no qual foi deletado do seu genoma a região codificadora da peptidase leader Lbpro, causou menor efeito citopático do que o vírus não
deletado. Porém, este vírus demonstrou crescimento similar ao vírus que continha a Lbpro nas células do tipo BHK-21(Baby Hamster Kidney), sugerindo que a Lbpro não é
requerida para o crescimento viral (Piccone et al., 1995).
Posteriormente, quando o LLV2 foi inoculado em animais, foram evidenciados sinais clínicos de febre aftosa mais brando e o vírus não foi transmitido aos animais não inoculados que estavam em contato. Isso indicou que a virulência do FMDV está relacionada à presença da Lbpro, ou seja, ela é importante para
causar a forma mais aguda da febre aftosa e permitir a transmissão entre os animais que são suscetíveis à doença (Chinsangaram et al., 1998; Mason et al., 1997).
A clivagem do eIF4G acarreta a dimuição da síntese dos interferons tipo I pelas células do hospedeiro. A supressão da produção IFN permite a rápida replicação e disseminação do FMDV nas células do hospedeiro. No entanto, o mutante LLV2 replicou de maneira ineficiente em células capazes de sintetizar
ambos IFNα e β. Células previamente tratadas com o IFNα⁄β tornaram-se resistentes ao FMDV (Chinsangaram et al., 1999 & 2001 ).
Lbpro é uma cisteíno-peptidase da família da papaína e apresenta um
grau de homologia maior que 15% quando sua estrutura primária é comparada com esta enzima (FIGURA 13). As duas peptidases também possuem grandes semelhanças na estrutura tridimensional apresentando dois domínios, sendo que um deles é predominantemente formado por α-hélices e o outro por folhas β (FIGURA 14).
As peptidases da família da papaína são caracterizadas pela tríade catalítica Cys/His/Asn. A Lbpro possui um ácido aspártico no lugar da asparagina no
FIGURA 13. Estrutura primária da papaína, ERV-1, e Lbpro (sorotipos FMDV-01K, FMDV-A10, FMDV-SAT2 e FMDV-C1). Adaptado de Guarné et al., 1998.
FIGURA 14. A) Lpro B) Papaína. Adaptado de Seipelt et al., 1999
A estrutura da Lbpro apresenta uma região compacta globular com uma
dimensão de aproximadamente 30 Å de diâmetro, formada por 172 resíduos de aminoácidos, possuindo uma região C-terminal (CTE), constituída pelos resíduos D184 ao K201.
Os resíduos catalíticos C51 e H148 se encontram no topo da fenda que separa os dois domínios, como observado em outros membros da família da papaína, ou seja, a localização e o arranjo espacial dos resíduos catalíticos são bem conservados nessa família de enzimas como mostra a FIGURA 14.
FIGURA 15. A) Centro ativo da Lpro. B) Centro ativo da Papaína. Adaptado de Guarné et al., 1998.
A papaína possui um resíduo de triptofano (W177) em seu sítio ativo
(FIGURA 15) e acredita-se que esse resíduo estabilize as pontes de hidrogênio formadas entre a H159 catalítica e o resíduo de N175 no estado de transição formado
durante a catálise. Esse resíduo de triptofano é ausente na Lbpro, e os resíduos
catalíticos H148 e C51 são expostos ao solvente. Diferente dos outros membros da família da papaína, o sítio ativo da Lbpro contém um grupo de resíduos carregados
negativamente D163, D164, E165 e D166 (Guarné et al., 1998).
A extensão C-terminal (CTE) flexível de 18 aminoácidos (DQEPLNGEWKAKVQRKLK) está envolvida na auto-clivagem da Lbpro na
poliproteína viral. Para isso, a CTE (FIGURA 13) se dobra dentro do sítio ativo da enzima, e uma clivagem intramolecular ocorre (Cencic et al., 2007).
As principais interações da CTE com o sítio ativo da Lbpro, ocorrem
através dos seus resíduos K201 e L200.
A porção alifática da cadeia lateral da K201, que ocupa o subsítio S1, é
E147, enquanto o grupo amino estabelece interações eletrostáticas com os
carboxilatos do E96 e E147. Nos outros membros da família da papaina o subsítio S1 é
um local amplo e irrestrito, exercendo pouca influência na especificidade do substrato. A cadeia lateral da K200 é completamente enterrada no subsítio hidrofóbico S2, formado pelos resíduos W52, G97, P100, L143, E147-A149 e L178 (FIGURA
16 A).
A arquitetura do subsítio S2 na Lbpro é muito similar ao da papaína. Aliás,
todos os resíduos são idênticos entre as duas enzimas, com exceção da L143, que equivale à V133 na papaína.
Os resíduos da CTE, K199(P3) e R198(P4), ocupam os subsítios S3 e S4,
respectivamente. A porção alifática da cadeia lateral da K199 realiza interações de
van der Waals com os átomos da cadeia principal dos resíduos G97 e G98. O grupo amino desses dois resíduos faz uma ponte de hidrogênio com a carbonila da cadeia principal do E93 e interage através de uma interação iônica com os carboxilatos das cadeias laterais do E93 e E96. A interação da R198 é através de forças de van der Waals com G98, P99, L143 e extensivamente com Q146. O grupo guanidino da R198,
também realiza pontes de hidrogênio com o grupo amida da cadeia lateral da Q146 (Guarné et al., 1998).
A α-hélices α1 e α3 são as mais longas (dos resíduos N50- E64 e L78-G91,
respectivamente), sendo que as duas α-hélices se estendem de maneira perpendicular, com a C51sendo localizada rumo ao N-terminal da α-hélice α1. A α- hélice mais curta α2 é formada de apenas seis resíduos de aminoácidos (F68-S73) e se estende de maneira pararela à α-hélice α3.
O segundo domínio da Lbpro é formado por uma mistura de folhas β em
paralelo (β3 com β4) e seis folhas β estendidas de maneira antiparalela (β4-β9). A H148 catalítica é localizada na volta que conecta as folhas β5 e β6 (formadas pelos resíduos F137-L143 e A149-T155, respectivamente).
As regiões mais conservadas entre a papaína e a Lbpro estão localizadas
ao redor do sítio ativo, especialmente entre as sequências das α-hélice α1 e folhas β5 e β6, que contém os resíduos do sítio catalítico C51e H148.
A cristalografia de raio X mostrou que a CTE de uma molécula da enzima está no centro ativo de uma molécula adjacente e vice-versa formando um dímero. Esses dados cristalográficos sustentam também a hipótese de que uma clivagem intermolecular é possível de ocorrer (Cencic et al., 2007).
Em solução também ocorre a formação do dímero, fato este confirmado por gel filtração e ressonância magnética nuclear. Para uma melhor compreensão do papel da CTE, uma enzima mutante para a Lbpro foi construída, denominada sLbpro,
onde a extensão C-terminal apresenta apenas 12 aminoácidos (D184-K195). A CTE da mutante apresentou-se em solução de maneira desordenada e flexível na análise por ressonância magnética nuclear, e não ocorreu formação de dímero (Cencic et al., 2007).
FIGURA 16. A) Resíduos de aminoácidos dos subsítios S1-S6. B) Estrutura terciária da Lbpro. Adaptado de Guarné et al., 1998.
A
A CTE juntamente com os resíduos Cys133 , D184 e E186 da Lb
pro (FIGURA
17), estão envolvidos no reconhecimento do eIF4GI . A interação da enzima com o fator eucariótico eIF4GI ocorre através dos resíduos K643, K646 e E650. Essas interações foram demonstradas através de mutações sítio-dirigidas nos resíduos D183 e E186 da Lbpro e K643, K646 e E650 do eIF4GI. As substituições desses resíduos
por alanina reduziram a interação do fator eucariótico eIF4GI com a enzima(Foeger et al., 2005).