2.1.6.1. Akış Debisi Değişimi Yöntemi
Değişik perfüzyon akış debilerinde gerçekleştirilen bu kalibrasyon yöntemi 1985 yılında geliştirilmiştir87. Bağıl gerielde akış debisine bağlıdır. Akış debisi sıfır olduğunda, MD için denge koşulu sağlanır ve gerçek örnek derişimleri elde edilir. Farklı akış debilerine karşı ölçülen derişimler grafiğe geçirilerek, sıfır akış debisine ekstrapole edilirse, sıfır akış debisindeki derişim kestirilebilir ve böylece probun bağıl gerieldesi kestirilir. Bu yöntemin dezavantajı, çok düşük akış debilerinde, örnek toplama zamanının uzun olması ve buna bağlı olarak zamana bağlı ayırımın kötüleşmesidir. Ayrıca sıfır akış debisine ekstrapole etmek, gerçek gerieldenin sadece bir kestirimidir ve gerçek değeri saptamak olası değildir. Bununla birlikte, sıfır akış debisindeki hatayı en aza indirebilmek için, deney tasarımına çok düşük akış debisindeki ölçümleri dahil etmek gereklidir65, 87.
2.1.6.2. Denge Yöntemi (No-net-flux Yöntemi) (Zero-net flux Yöntemi) Bu yöntemde farklı perfüzat derişimleri kullanılır. Yöntem, denge koşullarında probların in vivo kalibrasyonu için Lönnroth ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir37. Bu kalibrasyon yönteminde, farklı derişimlerde bileşik içeren perfüzat ile perfüzyon gerçekleştirilir. Eğer perfüzat derişimi, prob çevresindeki derişimden düşük ise; bileşik membrandan perfüzata doğru difüze olur ve dializat derişimi, perfüzat derişiminden yüksek olur. Eğer tam tersi ise, perfüzat derişimi, prob çevresindeki derişimden yüksek ise dializat derişimi, perfüzat derişiminden daha düşük olur. Perfüzat derişimi dializat derişimine eşit olduğunda özel bir durum ortaya çıkar. Bu
durumda prob çevresindeki derişim, perfüzat derişimi ile aynı olacaktır ve bu durum net akışın sıfır olması ile sonuçlanacaktır.
Farklı perfüzat derişimleri, perfüzat ile ilişkili olarak dializattaki bileşik kazancı veya kaybına (Cdializat-Cperfüzat) karşı grafiğe geçirilir. Apsisin
kesişimi, prob sıvısındaki derişimi verir. İn vivo prob gerieldesi ise, regresyon doğrusunun eğiminden hesaplanır. Yöntemin dezavantajı, farklı perfüzat derişimleri ile kalibrasyon yapılması gerektiğinden, çok zaman alması ve bu zaman boyunca da denge koşuluna gereksinim duymasıdır. Bu nedenle bu yöntem, klinik çalışmalarda uygun bir kalibrasyon yöntemi değildir65, 73.
2.1.6.3. Retrodiyaliz
Retrodiyaliz, diğer kalibrasyon yöntemlerinin zaman alıcı olması ve farklı hayvan/insanların kullanılmasına gereksinim duyması ve bu nedenle de klinik çalışmalarda uygulanabilir olamaması nedeniyle önem taşımaktadır65, 73. Retrodiyaliz, insan FK çalışmaları için en uygun yöntem olarak Stahle ve ark. tarafından önerilmiştir88. Ayrıca yöntem, hasta veya gönüllünün fazladan bir strese maruz kalmasını da engellemektedir. Retrodiyaliz, çalışmalarda yüksek tekrarlanabilirliği olan, daha az zaman isteyen, en pratik kalibrasyon yöntemidir68. MD yöntemi ile insanlar üzerinde yapılan FK çalışmalarda, ekzojen ve endojen bileşiklerin dağılımı çalışmalarında, bu yöntem ile uygun prob kalibrasyonu sağlanabileği ispatlanmıştır89-91.
Bu yöntemin prensibi difüzyon prosesinin membranın her iki yönünde de eşit olduğu varsayımına dayanır. Bileşik bilinen bir derişimde perfüzyon ortamına eklenir (Cperfüzat), ve membran boyunca kayboluş hızı
(gerielde) saptanır. Bileşiğin membrandan kaybı, in vivo gerieldeye eşittir. İn vivo gerielde değeri, Eşitlik 4 ile hesaplanır92.
% Gerielde = 100 1 Cdializat
Cperfüzat Eşitlik 4
Retrodiyaliz, ilaç derişimlerini ölçmek için kullanılacağı zaman, gerielde deneyleri, ilacın ilk uygulanmasından önce yapılmalıdır. İlaç derişimleri in vivo gerielde için düzeltilerek, zamana karşı derişim profilleri oluşturulur67, 73.
Bağıl gerieldenin tam olarak doğru saptanabilmesi olanaksızdır. Fakat klinik uygulamalarda yakın bir kestirim yeterlidir. Çünkü MD ile interstisyel derişim ölçümleri için bireyleriçi varyasyonun, bileşiğe bağlı olarak % 10-20 kadar olduğu gösterilmiştir93.
Retrodiyaliz yönteminin bir başka uygulaması da, in vivo gerieldeyi saptamada internal standart kullanılmasıdır94. Bileşik ile aynı özelliklere sahip olan bir internal standart perfüzat ortamına eklenir. Deney boyunca hem bileşiğin, hem de internal standartın derişimleri saptanır. Böylece MD membranından internal standartın kaybı, bileşiğin bağıl gerieldesini kestirmek için kullanılır. Bu yaklaşım, deney boyunca gerieldedeki değişimleri saptama avantajını sunar. Fakat in vitro gerieldeleri aynı olsa bile, internal standart ve bileşiğin in vivo sonuçları farklı olabilir95.
2.1.6.4. Endojen Referans Bileşiği Yöntemi
Bağıl gerieldenin saptanabilmesi için endojen bileşiklerin referans olarak kullanılması bir diğer yaklaşımdır. Ürenin kolay difüze olabilen bir molekül olmasından dolayı, gerieldenin belirlenmesinde endojen bir bileşik olarak kullanılabileceği belirtilmektedir96. Fakat bu yönteme yönelik sonuçlar çelişkilidir97,98. Glukoz ve parasetamol için, üre endojen
bileşiğinin kullanıldığı kalibrasyon çalışmasında, üre kalibrasyonu, denge ve retrodiyaliz yöntemleri ile karşılaştırılmıştır. Glukoz için yöntemin, denge ve retrodiyaliz yöntemlerinden farklı sonuçlar verdiği bulunmuştur. Parasetamol için ise, gerielde değerleri açısından yöntemler arasında
anlamlı bir fark bulunamamıştır97. Ürenin internal standart olarak MD kalibrasyonunda kullanıldığı başka bir çalışmada, glukoz, laktat ve gliserol için, endojen referans yönteminin denge ve internal referans (retrodiyaliz) yöntemleri ile anlamlı korelasyon gösterdiği bulunmuş ve ürenin endojen referans olarak kullanılabileceği gösterilmiştir98. Yapılan bir çalışmada, böbrek yetmezliği olan hastalarda, kan üre seviyelerinin bir göstergesi olarak, ters iyontoforez yöntemi ile, deriden üre seviyelerinin ölçülebileceği de bildirilmiştir99.
2.1.6.5. Diğer Kalibrasyon Yöntemleri
İn vitro gerielde bir bileşiğin bağıl gerieldesi ile ilgili ön bir bilgi almayı sağlamaktadır. İn vitro gerielde için, hem diyaliz, hem de retrodiyaliz yöntemleri kullanılabilir, çünkü difüzyon prosesi her iki yönde de eşit olarak kabul edilir. Fakat in vitro sonuçlardan in vivo gerieldenin ekstrapolasyonu olası değildir. Örneklenen dokunun yapısı ve bileşik ile etkileşimi gerieldeyi etkiler71,100. Genellikle, in vitro gerielde, in vivo
gerieldeden daha yüksektir. İn vivo koşullarda bağıl gerielde, ekstrasellüler boşluğun hacmi, eğrilik büğrülüğü, ilaç salımı ve alımı (uptake) ve klirens prosesleri gibi etkenlerden etkilenir65.