MENKUL SERMAYE İRATLARI

T.cruzi

Para investigar se o PSI, um inibidor do proteassoma 20S, modulararia a expressão de HslV e do proteassoma 20S, epimastigotas das populações Be-62, Be-78 e Y foram cultivados na presença de PSI, como descrito em Material e Métodos e os níveis detectados como descrito anteriormente.

Na Figura 20A podemos observar que o PSI teve efeito na expressão da HslV apenas na população Be-62 promovendo aumento em torno de três vezes na quantidade desta protease. Porém, a Figura 19B mostra que o PSI teve efeito inverso sobre os níveis do proteassoma 20S na população Be-62, com uma expressão cerca de duas vezes menor em parasitos cultivados na presença do PSI. Também podemos observar na Figura 20B que o PSI afetou a expressão do proteassoma 20S na população Y aumentando sua quantidade em, aproximadamente, 4 vezes. Na população Be-78 não foram observadas alterações na expressão em ambas proteases.

72 Figura 20: Análise da expressão relativa por Western blot da HslV e do proteassoma 20S em diferentes populações de T. cruzi cultivadas na presença e ausência de PSI. Cerca de 50 µg de

proteínas totais foram fracionados em gel de poliacrilamida 12%, transferidos para membrana de PVDF, incubados com anticorpo anti-TcHslV e anti-Tcalfa7 do proteassoma 20S de camundongo e revelado com NBT/BCIP. Os níveis de expressão relativa foram obtidos pela análise densitométrica das bandas utilizando o programa Quantity one® (Bio-Rad). Como normalizador foi utilizado anticorpo anti-TcHsp70 de coelho. A análise estatística foi realizada utilizando o teste T de Student com P<0,05 no programa GraphPad Prism. Em (A), níveis de expressão relativa da HslV. Em (B), níveis de expressão relativa do proteassoma 20S. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo símbolo * indicando diferença em relação a cepa correspondente cultivada na ausência de PSI.

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Em abril de 1909, Carlos Chagas (1878-1934), pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz, comunicou ao mundo científico a descoberta de uma nova doença humana, a DC, seu agente causador (T. cruzi) e o seu inseto transmissor (triatomíneo conhecido como ―barbeiro‖). A DC sempre esteve associada à zona rural em especial as populações mais carentes e sua transmissão clássica ocorre quando o inseto vetor realiza o repasto sanguíneo e logo em seguida defeca, liberando o T. cruzi juntamente com suas fezes. Este parasito penetra na pele danificada ou em mucosas. Assim, em 1991, como intuito de combater a doença, iniciou-se um processo de erradicação vetorial nas zonas rurais do Brasil e em 2006 a Organização Mundial de Saúde decretou no país o fim da infecção pelo contato direto com o inseto vetor (http://www.fiocruz.br/chagas).

Nos últimos cinco anos, cerca de 600 pessoas foram contaminadas por via oral com o T. cruzi e o número de casos registrados crescem em média 20% ao ano. A grande preocupação com a contaminação por alimentos é dificuldade de controle, uma vez que não está limitada a uma população/região geografica específica. Outro fator preocupante é que a DC, considerada uma doença da América Latina, vem crescendo nos países europeus e da América do Norte devido à imigração de latinos americanos. Nesses países a transmissão se dá principalmente por transfusão sanguínea.

O nitroderivado Benzonidazol (Bz) é a droga usualmente utilizada no tratamento da DC, entretanto, vale a pena ressaltar que este fármaco apresenta baixos índices de cura, variando de acordo com a área geográfica, provavelmente devido a diferenças genéticas nas cepas encontradas nas diferentes regiões (FILARDI & BRENER, 1987; GIOVANNI-DE-SIMONE e cols., 1987; LEVI e cols., 1996; STOPPANI, 1999). Isto talvez possa explicar os resultados contraditórios obtidos após o tratamento específico para a DC (ANDRADE e cols., 1985; FILARDI & BRENER, 1987). Os efeitos colaterais produzidos pelo Bz incluem náuseas, vômitos, perda do apetite e de peso, intoxicações e fenômenos alérgicos que comprometem a manutenção do tratamento. Estes fatos tomados conjuntamente evidenciam a importância da identificação de novos alvos terapêuticos e fármacos a serem utilizados na quimioterapia da DC (CROFT, 1999; ENGEL e cols., 1998; URBINA, 2003). Apesar deste cenário, a DC é classificada como uma doença

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negligenciada sendo considerada prioritária a descoberta de novos fármacos e alvos mais eficazes para seu tratamento.

Neste sentido, as proteases dos parasitos receberam uma atenção considerável na ultima década, o que levou à caracterização de seu papel na interação parasito-hospedeiro. Um parasito bem sucedido deve conseguir penetrar e sobreviver no interior do hospedeiro, assimilando os componentes necessários à sua nutrição e conseguindo escapar da resposta imunológica do mesmo (CAZZULO e cols., 2002; ROIKO e cols., 2009).

A degradação de proteínas é a chave de muitos processos celulares. Todos os organismos possuem processos específicos para degradar proteínas em aminoácidos livres e assim regular o seu proteoma. Proteases ATP- dependentes são geralmente complexos compartimentalizados, altamente regulados e formados por várias subunidades, cuja função requer energia proveniente da hidrólise de ATP. Dentre esses complexos compartimentalizados, podemos citar duas treoninas proteases, o complexo HslV/U e o proteassoma 20S, cuja coexistência foi descrita em T. cruzi.

O proteassoma está envolvido com a principal via de proteólise intracelular não lisossomal, em células eucarióticas (revisto por CIECHANOVER, 2006; GOLDBEG, 2007). Sabe-se que sob determinadas condições, na mesma célula diferentes grupos de proteínas podem ser enviados para o proteossoma por diferentes mecanismos.

O papel do proteassoma 20S no desenvolvimento de T. cruzi é estabelecido. Cardoso e cols. (2008) demonstraram que epimastigotas de T. cruzi incubados com um inibidor do proteassoma, a lactacistina, apresentam crescimento celular e a metaciclogênese inibidos in vitro, com arraste celular na fase G2 do ciclo celular. Hangai e cols. (artigo em preparação) demostraram que a adição de PSI, epoximicina e MG132, bloqueiam a replicação de epimastigotas das cepas Be-62, Be-78 e Y do T. cruzi, corroborando a hipótese de que o processo de replicação do

T. cruzi envolve o proteassoma.

Hangai e cols. (artigo em preparação) também mostraram que o uso de tripomastigotas sanguíneos das populações Be-62, Be-78 e Y do T. cruzi, pré- tratados com PSI, para reproduzir o desenvolvimento da DC em modelo murino, promoveu uma inibição na parasitemia de 68, 42 e 73% respectivamente quando

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comparado ao grupo controle (animais inoculados com parasitos não tratados com PSI).

Além disso, foi verificado que o tratamento prévio de tripomastigotas sanguíneos da população Y do T. cruzi com PSI alterou seu tropismo tecidual aumentando o parasitismo nos músculos cardíaco e esquelético e diminuindo no baço e fígado. Considerando que a população Y é descrita na literatura com reticulotrópica, este resultado abre questões interessantes sobre a contribuição de um proteassoma funcional para o estabelecimento da DC (BRENER e cols., 1973).

Esses dados em conjunto, sugerem que o proteassoma é essencial para a manutenção do ciclo biológico do T. cruzi, uma vez que a inibição desta protease na fase replicativa (epimastigota) além de bloquear o ciclo celular, induz alterações morfológicas, enquanto que uma inibição na fase infectiva, compromete a progressão da infecção experimental e altera a progressão da DC.

Entretanto a caracterização recente do complexo HslV/U em parasitos protozoários e a existência de genes preditos para este complexo no genoma do T.

cruzi (http://www.genedb.org/Homepage/Tcruzi) permitiu construir uma hipótese de

que esta treonina protease, que também é bloqueada por inibidores clássicos dos proteassomas, como por exemplo, MG132, possa exercer um papel importante na biologia celular dos parasitos protozoários. O compexo HslV/U é considerado precursor do proteassoma 20S (BOCHTLER e cols., 1999), e seu componente treonina protease, a HslV, apresenta 20% de similaridade com as subunidades beta do proteossoma 20S (BOCHTLER e cols., 2000).

Levando em consideração os dados citados acima e que as diferentes manifestações clínicas da DC são determinadas, entre outros fatores, pela grande diversidade das populações de T. cruzi, que apresentam características genéticas de virulência, tropismo tecidual, antigenicidade, bioquímicas e de resistência a drogas extremamente variável (LIMA e cols., 1999), neste trabalho nós apresentamos a caracterização molecular inicial da treonina protease HslV de T.

cruzi, bem como a análise comparada da expressão da HslV e do proteassoma 20S

em populações com diferentes genótipos e fenótipos da DC.

Considerando que a regulação da expressão gênica em T. cruzi é predominantemente pós-transcricional e os resultados de expressão gênica em larga escala de T. cruzi, utilizando plataformas de microarranjos, nós adotamos como

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critério, para inferir um padrão diferencial da expressão dos transcritos codificantes para hslv ,hslu, beta -1, -2, e -5, uma variação da ordem de dois (KOUMANDOU e cols. 2008; MINNING e cols. 2009, JENSEN e cols. 2009).

Os níveis de mRNA dos genes beta -1 e -5 não apresentaram variações entre as populações de T. cruzi estudadas (Figura 10A e C). Porém, o gene beta -2 foi 4,5 vezes menos expresso em Be-62 quando comparado as outras populações. Quando comparamos os diferentes genes dentro da mesma população, observamos que

beta -2 sempre foi menos expresso em comparação à beta -1 e -5 que apresentaram

níveis equivalentes de transcrição.

No banco de dados do T.cruzi (http://www.genedb.org/Homepage/Tcruzi) são encontradas duas entradas para a subunidade Beta -1 (Tc00.1047053507603.40 e

Tc00.1047053509429.110) e outras duas para subunidade Beta -5

(Tc00.1047053503781.70 e Tc00.1047053507639.40) do proteassoma 20S. Os iniciadores foram desenhados utilizando as sequências sublinhadas, porém as duas sequências para o gene beta -1 e as duas para o gene beta -5 apresentam alta identidade entre si e os iniciadores desenhados, quando submetidos à busca de homologia no banco de dados GeneDB, alinham com ambas as entradas. Já para a subunidade Beta -2 do proteassoma 20S são encontradas três entradas no GeneDB

para T.cruzi (Tc00.1047053510287.30, Tc00.1047053503891.100 e

Tc00.1047053508461.430). A entrada utilizada para o desenho do iniciador foi aquela que apresentou maior similaridade com as ortólogas para o gene beta -2 (entrada sublinhada). Contudo, ela é significativamente diferente das outras duas e quando o iniciador é submetido à busca de homologia no banco de dados GeneDB, ele alinha apenas com a sequência usada para desenhá-lo. Dessa forma, qualquer um dos alelos transcritos para os genes beta -1 e -5 foram identificados pelos nossos iniciadores, mas apenas um alelo para o gene beta -2 poderia ser identificado. Essa diferença pode ter se refletido nos resultados encontrados para os níveis de transcritos, justificando uma menor expressão do gene beta -2. Diferenças no padrão de transcrição de alelos têm sido descritos na literatura (Cevallos, e cols. 2003).

Oliveira (2007) analisou o número de copias dos genes beta-1, -2 e -5 em populações do T. cruzi com fenótipo de resistência ou susceptibilidade ao benzonidazol e demonstrou que existem populações, como por exemplo, Y e Be-78

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que possuem 3 cópias para o gene beta-2 e duas cópias para os genes beta 1 e -5. Esse arranjo gênico não foi observado para a população Colombiana. Essa variação no número de cópias dos genes codificadores para as subunidades do tipo beta catalítica sugere um mecanismo de amplificação gênica relacionado a estes genes nas populações de T. cruzi, o que poderia explicar variações nos níveis dos transcritos entre as populações deste parasito. Futuros experimentos serão realizados para verificar se as diferenças descritas neste trabalho podem estar relacionadas ao número de copias destes genes.

Em relação aos constituintes do complexo HslV/U, a subunidade HslV teve uma expressão variável entre as populações estudadas, sendo menos expressa em Be-78 e mais expressa em Cl. O nível de transcrito para o gene da hslu não variou entre as populações e comparado aos demais genes, apresentou expressão similar ao gene beta -1 em todas as populações estudadas. Comparando- se os genes hslv e hslu, este último mostrou ser mais expresso em relação à hslv nas populações Be- 62, Be-78 e Colombiana. Sabe-se que a expressão gênica em tripanossomatídeos é regulada principalmente à nível pós- transcricional. Dessa forma, como não realizamos experimentos para analisar a quantidade protéica de HslU não podemos afirmar a existência de expressão diferencial nas populações T.cruzi ente os constituintes do complexo HslV/U.

Vale a pena ressaltar que descartamos a possibilidade das diferenças nos níveis de mRNA determinadas por qRT-PCR estarem relacionadas com a qualidade da preparação do RNA total, cDNA ou degradação da amostra, haja visto que foram utilizadas as mesmas preparações de RNA total de cada população para avaliar os diferentes genes e o perfil observado foi o mesmo na duplicata biológica.

Para avaliar os níveis protéicos da subunidade HslV do compelxo HslV/U e do proteassoma 20S, primeiramente, nós obtivemos as proteínas recombinantes TcHslV e TcHslU para posterior produção de anticorpos policlonais. A Figura 15 mostra que ambas foram obtidas na fração insolúvel do extrato total de E. coli, em corpos de inclusão e a Figura 16 mostra a eficiência da purificação da TcHslV e TcHslU recombinantes. Para ensaios de atividade proteolítica utilizando substratos fluorogênicos, foram feitas tentativas para a produção da TcHslV e da TcHslU solúveis, alterando-se as concentrações do IPTG, utilizado para induzir a expressão em E. coli (BL21(DE3)pLysE), o tempo de indução e adicionando-se etanol. Porém,

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todas as tentativas se mostraram insuficientes para obter a proteína solúvel (dados não mostrados). As proteínas recombinantes expressas em corpúsculos de inclusão não poderiam ser utilizadas para medir a atividade do complexo, pois não são enoveladas corretamente. Novos experimentos serão realizados para obtenção das proteínas HslV e HslU na forma solúvel e a realização de medidas enzimáticas para determinar o tipo principal de atividade peptidásica da subunidade HslV.

A Figura 17 mostra a confirmação da identidade das proteínas recombinantes TcHslV e TcHslU, com cobertura de 66% e 54%, respectivamente, recuperadas do banco de dados de T. cruzi (http://www.genedb.org/Homepage/Tcruzi). Além disso, a Figura 17 mostra a grande similaridade entre a sequência da HslV de T. cruzi e suas ortólogas. Esta alta similaridade também é vista para a componente ATPase do complexo HslV/U de T. cruzi, a HslU. Esses resultados corroboram com os descritos por Couvreur e cols. (2002), que utilizando dados parciais do sequenciamento genômico do T. cruzi, demonstrou alta conservação das sequências da HslV e HslU entre eucariotos inferiores (Plasmodium sp, Tripanosoma sp, Leishimania sp) e procariotos (Ruiz-González et al., 2005). Nossos resultados também são corroborados com as estruturas tridimensionais obtidas a partir da HslV de T. brucei (CHING C. WANG , 2008) e para P. falciparum (RAMASAM, G. e cols., 2007).

Comparando com as sequências da HslV e HslU de alfa- proteobactérias, RUIZ-GONZÁLEZ e cols. (2005) sugeriram que estes genes foram transferidos para os eucariotos em um processo de endossimbiose, envolvendo proteobactérias que deram origem as mitocôndrias.

Volker e Lupas (2002) e Couvreur e cols. (2002), sugerem que o proteassoma 20S e o HslV/U são complexos alternativos e que ambos foram transferidos horizontalmente, onde o proteassoma foi transferido dos eucariotos para os acitomicetos e o HslV/U por endossinbiose dos procariotos para eucariotos. Uma outra hipótese é que o HslV/U seja precursor do proteassoma e que este tenha aparecido em acitomicetos por uma modificação do complexo HslV/U e, posteriormente, arquea e eucariotos receberam o proteassoma por derivarem dos acitomicetos (CAVALIER-SMITH, 2004). A presença do complexo HslV/U seria novamente explicada pela transferência horizontal por endossimbiose. Contudo, é necessário maior entendimento nas relações evolutivas entre eubactérias, arquea e eucariotos para compreender a origem das proteases proteassoma 20S e HslV/U.

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As proteínas TcHslV e TcHslU foram utilizadas para produção de anticorpos policlonais. Todavia, apenas o anticorpo anti-TcHslV foi produzido em camundongos em colaboração com o Instituto Oswaldo Cruz em Curitiba, Paraná. Apesar de ter 20% de similaridade com as subunidades beta do proteassoma 20S e dos anticorpos serem policlonais, o anticorpo evidenciou uma única banda com massa molecular prevista para a HslV (~22,8KDa) sugerindo a especificidade da reação, como observado na Figura 18A. Após confirmar a especificidade do anticorpo, foram avaliados os níveis desta proteína em extrato total de epimastigota obtida de várias populações de T. cruzi.

Para comparação dos níveis protéicos, foi considerado como variação da expressão das proteases analisadas, quando a diferença foi igual ou superior a 1,5 vezes. Nossos resultados mostraram variação na quantidade protéica entre as populações de T. cruzi estudadas para ambas as proteases (Figura 18). A população Y apresentou maior nível de HslV quando comparado as demais e o contrário foi visto para o proteassoma 20S, porém não há diferenças entre os níveis das duas treoninas proteases dentro desta população (Figura 19). A maior quantidade de proteassoma 20S foi verificada na população Be-62, sendo três vezes mais abundante em relação à população Y. Contudo, tal relação foi inversa para os níveis de HslV (Figura 18). Os níveis protéicos de HslV foram relativamente equivalentes entre as populações Be-62, Be-78, Cl e Colombiana (Figura 18A). Para os níveis de proteassoma 20S, foi verificada equivalência ente as populações Be-78 e Cl, e entre Colombiana e Y (Figura 18B). A comparação entre os níveis protéicos das duas proteases dentro da mesma população mostrou diferenças para Be-62, Be-78, Cl e Colombiana, sendo essa diferença mais expressiva na população Be-62 (Figura 19).

Apesar da variação dos níveis protéicos e de transcritos de ambas treoninas proteases, os níveis de mRNA e de proteína não se correlacionam. Enquanto Be-62 apresenta maior nível protéico de proteassoma 20S e menor de HslV quando comparado a população Y, os níveis de transcritos entre as duas populações para os genes beta -1, -5 e hslv são similares. A população Cl apresenta baixa quantidade da proteína HslV, mas foi a população que apresentou maior nível de transcrito para essa protease.

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Sabe-se que em tripanossomatídeos, os mRNAs são processados de transcritos policistrônicos através de trans-splicing e poliadenilação. Em adição, genes de um mesmo transcrito policistrônico geralmente não estão relacionados com a mesma via metabólica sugerindo outros mecanismo de regulação, como estabilidade de mRNA e sua acessibilidade para a maquinaria de tradução (revisto por MARTÍNEZ-CALVILLO, 2009).

Os processos de trans-splicing e poliadenilação são acoplados e, se os precursores de degradação de mRNA forem mais rápidos que o splicing, o mRNA será pouco transcrito. Em T. brucei, três genes para enzima fosfoglicerato quinase (PKG) estão na mesma unidade policistrônica e são co- transcritos, porém o mRNA do primeiro gene (PGKA) está presente em baixos níveis devido, provavelmente, a uma lentidão no mecanismo de splicing (CLAYTON, C e cols., 2007). Além disso, o mRNA pode ser estabilizado por ligação de proteínas adicionais e a transcrição aumentada, mas após 0,2-4 horas eles são desadenilados e degradados (CLAYTON, C e cols., 2007). A degradação de mRNAs inicia-se com a desadenilação em eucariotos, tipicamente, seguida de decapeamento e degradação do mRNA por 5’ exonucleases ou direcionando o mRNA para complexos denominados exossomos, onde são degradados via 3’- exonucleases (HAILE, S e cols., 2007). Em tripanossomatídeos tem sido descritas duas via de degradação de mRNA. A via constitutiva ocorre de maneira lenta e dependente de desadenilação. Esta via é responsável por degradar mRNAs estáveis e uma subpopulação de mRNAs instáveis. A via regulada é desadenilação-independente e ocorre de maneira rápida, com participação do exossoma e endonucleases, responsável pela degradação de mRNAs instávies (HAILE, S e cols., 2007).

Um ponto de regulação durante o processo de tradução é a formação do complexo de iniciação da tradução, onde proteínas de ligação ao mRNA podem reprimir esse complexo, por competição com os fatores de iniciação (CHO, PF e cols., 2005; RICHTER, JD e cols., 2005). Assim, o fato de detectarmos diferenças ente os níveis de mRNA e de proteínas das proteases HslV e proteassoma 20S, em populações de T. cruzi poderia ser explicado por um desse fatores acima ou pela combinações deles.

Além das regulações já citadas, Holetz e cols. (2007) identificaram uma RNA helicase, Dhh1, em diferentes loci no citoplasma de epimastigotas de T. cruzi,

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sugerindo sua participação em estruturas semelhantes à processing bodies (P-

bodies). P- bodies são locais no citoplasma onde os mRNAs podem ser degradados

ou estocados para posterior tradução nos polissomas. Assim, outro fator que poderia explicar a não relação entre quantidade de mRNA e proteína das proteases HslV e proteassoma 20S, seria a presença de P-bodies, onde os mRNAs seriam preferencialmente sequestrados em determinadas populações de T. cruzi refletindo em uma diferença nos níveis protéicos.

Cardoso e cols. (2010) mostraram que durante a metaciclogênese não há variação nos níveis protéicos tanto da HslV quanto do proteassoma 20S em T. cruzi mas a atividade de tripsina e quimiotripsina-símile do proteassoma 20S em epimastigotas de 3 e 5 dias em meio LIT, em epimastigotas sob estresse nutricional e em epimastigotas aderidos após 12 e 24 horas de diferenciação são cerca de duas vezes superiores às atividades peptidásicas em tripomastigotas metacíclicos. Dados do nosso laboratório também mostraram que não há variações nos níveis de HslV e do proteassoma 20S em populações com mesmo genótipo e diferentes fenótipos de resistência ao Bz (17LER/17WTS, resistente e sensível ao Bz in vitro, e BZR/BZS, resistente e sensível ao Bz in vivo). Contudo houve diferenças das atividades do proteassoma 20S entre as populações com resistência ao Bz induzida in vitro, sendo a atividade de tripsina-símile maior na população 17LER em relação à 17WTS. Em populações com resistência induzida in vivo às atividades de tripsina e quimiotripsina- símile foram menores na população resistente BZR.

Considerando que tanto HslV como proteassoma 20S participam do processo de replicação e que inibidores do proteassoma 20S, como lactacistina e MG-132, bloqueiam o ciclo celular, também foi nosso objetivo verificar se haveria algum efeito sobre a tradução dessas treoninas proteases em epimastigotas de T. cruzi crescidos na presença de inibidor de treoninas proteases. Cardoso e cols. (2008) mostraram que epimastigotas de T.cruzi tem seu crescimento inibido na presença do inibidor