Pd(dmba)Cl(isn)] (4) e cisplatina.
O teste do MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) baseia-se na redução dos sais amarelos de tetrazólio por redutases mitocondriais de células metabolicamente ativas. Formam-se, intracelularmente, cristais azuis que são solubilizados e posteriormente analisados por espectofotometria UV/visível. Deste modo, quanto menor for a viabilidade celular, menor será a redução do MTT e menor o sinal espectofotométrico.
Foram realizados testes de viabilidade celular por MTT com macrófagos para
os compostos 3 (Figura17 B), 4 (Figura 18 B) e com a cisplatina (Figura 19 B) . Como comparativo, o MTT foi realizado com controle positivo adicionado a todas as
concentrações testadas. Além disso, foi realizado o teste de produção/inibição de NO, com os compostos 3 (Figura 17 A), 4 (Figura 18 A) e cisplatina (Figura 19 A) nas concentrações de 25 a 0,78 µg/mL. Foram tomados como base os valores das concentrações dos resultados dos compostos que apresentavam em média 100% de viabilidade celular, objetivando verificar se os compostos produziram ou inibiram NO.
Figura 17. (A) Ensaio de produção / inibição de NO com o composto 3. As colunas
em preto representam a produção de NO e as colunas hachuradas (em cinza) representam a inibição do NO nas diferentes concentrações. (B) Viabilidade dos macrófagos em contato com o composto 3, avaliada pelo teste do MTT. As colunas em preto representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas do composto, além do controle positivo (LPS) e controle negativo (RPMI). As colunas hachuradas (em cinza) representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas do composto adicionado o controle positivo em todas as situações. **** p<0,0001; ** p<0,01.
Na Figura 17 A, estão ilustrados os valores obtidos no teste de produção de NO. Apenas na concentração 12,5 µg/mL houve produção de 20 µMols de nitrito/mL e no controle positivo houve produção, sendo que para essa situação não houve significância estatística em nenhuma das concentrações testadas. Nos resultados de inibição houve significância estatística nas concentrações 25 e 12,5 µg/mL. Nas demais concentrações e no controle positivo não houve inibição. Exceto nas primeiras concentrações, apesar de que na concentração de 25 µg/mL houve morte celular de aproximadamente 50% no MTT, foi visível nessa concentração a inibição com significância estatística acentuada. E na concentração 12,5 µg/mL houve uma inibição aproximadamente de 60%. Houve também inibição no controle negativo, o que é esperado.
No resultado do ensaio do MTT, figura B com o composto 3, houve morte celular na concentração 25 µg/mL, apesar da morte celular, foi possível visualizar que houve inibição de NO nesta concentração pela substância. Porém na concentração 12,5 µg/mL foi possível observar o aumento na viabilidade celular em quase 100%. Portanto, na concentração 12,5 µg/mL pode-se afirmar que houve inibição de NO, no entanto, a inibição em termos de porcentagem foi menor se comparada com a concentração 25 µg/mL, que apesar de 50% de viabilidade, podemos dizer que nesta concentração teve inibição. Nossos resultados mostraram que a partir desta concentração o composto não foi citotóxico para os macrófagos, apresentando elevados de células viáveis. Não houve diferença estatística significativa no teste do MTT.
Figura 18. (A) Ensaio do efeito do composto 4 na produção / inibição de NO. As
colunas em preto representam a produção de NO e as hachuradas (em cinza) representam a inibição do NO nas diferentes concentrações. (B) Viabilidade dos macrófagos em contato com o composto 4 avaliada pelo teste do MTT. As colunas em preto representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas do composto, além do controle positivo (LPS) e controle negativo (RPMI). As colunas hachuradas (em cinza) representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas do composto adicionado o controle positivo em todas as situações. * p<0,05.
O ensaio para avaliar a produção de NO demonstrou que em contato com a substancia 4, para todas as concentrações testadas não houve significância estatística e o aumento da produção só foi observado no controle positivo. No teste de inibição houve significância estatística somente na concentração 25 µg/mL, onde a inibição foi expressiva, pois nessa concentração o composto 4 estimula a inibição. Portanto, assim como para o composto 3, podemos inferir que o composto 4 inibe NO na concentração 25 µg/mL e não produz NO na mesma concentração.
O teste do MTT com o composto 4 demonstrou 100% de na viabilidade celular em todas as concentrações testadas, porém sem significância estatística. No controle positivo (LPS) houve uma leve diminuição na viabilidade e o controle negativo manteve-se em 100%. Os resultados sugerem que a substância em questão não afetou a viabilidade celular.
Figura 19. (A) Ensaio do efeito da cisplatina na produção / inibição de NO. As
colunas em preto representam a produção de NO e as hachuradas (em cinza) representam a inibição do NO nas diferentes concentrações (B) Viabilidade dos macrófagos em contato com a cisplatina, avaliada pelo teste do MTT. As colunas em preto representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas com substância, além do controle positivo (LPS) e controle negativo (RPMI). As colunas hachuradas (em cinza) representam a porcentagem de células viáveis nas diferentes concentrações testadas da substancia adicionado o controle positivo em todas as situações. **** p<0,0001; ** p<0,01.
O teste do MTT realizado com a cisplatina apresentou uma diminuição na viabilidade celular para a maioria das concentrações testadas e para o controle positivo. Apenas nas menores concentrações a viabilidade ficou em 100% e para o controle negativo, demonstrando ser citotóxica em concentrações elevadas.
Os resultados do teste de produção e inibição de NO com cisplatina mostrou que nas maiores concentrações, entra 25 a 6,25 µg/mL há pouca produção de NO, porém nas concentrações mais baixas, entre 3,13 a 0,78 µg/mL houve um aumento na produção de NO em torno de 30 µMols de nitrito/mL, sem diferenças estatísticas significativas. No teste de inibição as quatro maiores concentrações apresentaram potencial inibidor, com diferenças significativas. Nas duas situações testadas, como esperado, não houve produção de NO quando as células foram expostas somente ao meio de cultura, controle negativo (RPMI).